发夹标记的探针及其使用方法技术

本发明专利技术提供了核酸杂交探针，其具有靶结合区域，和位于探针的至少一个末端的标记的发夹结构。发夹标记的探针包括寡核苷酸，树枝状聚合体和引物延伸的核酸。探针可用于所公开的检测靶核酸的方法。而且，寡核苷酸探针可用于所公开的引物延伸的方法，包括，例如，随机引发和ＰＣＲ扩增，以产生引物延伸的发夹标记探针。还公开了包含发夹标记的寡核苷酸和树枝状聚合体探针的试剂盒。此外，本发明专利技术提供了通过与标记的发夹结构连接而被标记的生物分子（例如，肽，多肽，碳水化合物，脂类，等等）。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请要求2003年7月7日提交的美国临时专利申请60/485,471的利益，其以其全部内容引入这里作为参考。
技术介绍
核酸杂交是检测靶核酸的一种有效方法。不过，目前的检测探针和方法具有某些损害在不同的应用中检测低水平靶核酸的能力的缺点。例如，由于它们的大小较小，寡核苷酸探针不能使用化学方法(例如，铂或补骨脂素化合物)或酶促方法(例如，随机引物标记，聚合酶链式反应标记或切口平移标记)容易地进行标记。最常见地，其合成期间或，可选择地，合成后，使用3′-末端标记进行寡核苷酸标记，其包括添加标记的核苷酸到寡核苷酸的3′-末端。可使用“链终止”核苷酸添加单一标记的核苷酸；可选择地，可使用非终止的核苷酸，导致添加多个核苷酸而形成“尾”(图1A)。然而，“形成尾”的缺点包括，例如，从一个实验到另一个实验中“尾”长度的变异性，一般添加的标记数量较少(大多数“具尾”寡核苷酸仅仅具有1-2个添加的标记)，以及只能标记较少量的寡核苷酸。对于合成标记，另一种常见方法，在化学合成期间，标记的核苷酸(例如，亚磷酰胺核苷酸)被掺入到寡核苷酸中。可以把标记添加到寡核苷酸的5’，3’末端或者两个末端(图1B)(参见，例如，美国专利No.5,082,830)，或ODN内部的碱基位置(图1C)。然而，由于存在大的标记分子引起的对寡核苷酸杂种稳定性的有害影响，内标记对靶核酸是不利的。更进一步地，内标记受到序列中存在的同源核苷酸数目的限制。目前的一些寡核苷酸探针包括形成发夹结构的核苷酸序列。(参见，例如，美国专利No.5,674,683；5,808,036；6,114,121。)但是，这些探针也具有如上所述的类似的缺点，例如，内部核苷酸被标记，或寡核苷酸在5’末端被标记。更进一步地，虽然其它具有发夹结构的寡核苷酸已经开发作为捕获探针(参见，例如，美国专利No.5,770,365；6,380377)，但是这些结构尚未计划用作具有增加的检测灵敏度的检测探针。因此，目前的杂交探针和方法，限制了核酸的检测能力，从而限制了它们在各种程序中的有效应用，包括诊断与分析应用。例如，使用目前的探针和方法，常常在无症状的患者中，无法检测到例如，人类免疫缺陷性病毒(HIV)，埃-巴二氏病毒(EBV)或巨细胞病毒(CMV)的病毒负荷，从而限制了其鉴定早期疾病或在潜伏期评估主要感染的细胞类型的能力。需要用于评估病毒感染的迅速的，灵敏的方法，包括病毒库的更精确的识别，以最佳化治疗介入。因此，本领域需要标记用于增加的检测灵敏度的寡核苷酸杂交探针。这里提供的组合物和方法满足这些及其它需要。
技术实现思路
本专利技术提供了标记的寡核苷酸，其包含(1)基本上与靶核酸互补的单链靶结合区段和(2)包含茎区域和环区域的发夹结构，其中发夹结构内的两个或多个核苷酸具有可检测标记。在某些实施方案中，标记的寡核苷酸在靶结合区段与发夹结构之间还包括接头。在不同的实施方案中，具有可检测标记的发夹核苷酸位于环区域，茎区域，或者环和茎区域两者内。在特定的实施方案中，至少5个核苷酸(例如，9个核苷酸)被可检测地标记。此外，在本专利技术的某些实施方案中，发夹标记的寡核苷酸可以具有，例如，至多60，至多100，或至多150个核苷酸。在其它的实施方案中，环区域具有3-10个核苷酸，和/或茎区域具有16-40个核苷酸。可检测标记的核苷酸可以相邻或者相隔至少2个核苷酸(例如，相隔2-6个核苷酸)。在一些实施方案中，靶结合区段是预先确定的区段(也即，根据预先确定的核酸如，例如，病毒核酸(例如，HIV或EBV核酸)而计划的)。在其它的实施方案中，靶结合区段是随机区段或简并区段。在其它的实施方案中，可检测标记是间接标记如，例如，生物素或半抗原(例如，地高辛配基，二硝基苯酚(DNP)，生物素和荧光素)。仍然在其它的实施方案中，可检测标记是直接标记如，例如，荧光团(例如，荧光素，罗丹明，德克萨斯红，藻红蛋白，Cy3和Cy5)。仍然在其它的实施方案中，本专利技术提供了一种标记的寡核苷酸，其包含(1)基本上与靶核酸互补的单链靶结合区段；(2)包含第一茎区域和第一环区域的第一发夹结构；和(3)包含第二茎区域和第二环区域的第二发夹结构；其中第一发夹结构内的至少一个核苷酸和第二发夹结构内的至少一个核苷酸具有可检测标记，而且其中发夹结构与靶结合区段的相对末端连接。在某些实施方案中，第一，第二或两个发夹结构内至少2个核苷酸被可检测地标记。在某些实施方案中，本专利技术还提供了一种树枝状聚合体(dendrimer)探针，其包含(1)两个或多个标记的寡核苷酸，其包含(a)基本上与靶核酸互补的单链靶结合区段和(b)包含茎区域和环区域的发夹结构，其中该发夹结构内的两个或多个核苷酸具有可检测标记；和(2)连接寡核苷酸的分支分子。仍然在其它实施方案中，本专利技术提供了一种标记的生物分子，其包含(1)形成包含茎区域和环区域的发夹结构的寡核苷酸，其中该发夹结构内的许多核苷酸具有可检测标记；和(2)连接寡核苷酸与生物分子的接头。本专利技术还提供了一种在样品中检测靶核酸的方法。该方法包括以下步骤(1)使样品与寡核苷酸探针接触，该寡核苷酸探针包含(a)基本上与靶核酸互补的单链靶结合区段；和(b)包含茎区域和环区域的发夹结构，其中该发夹结构内的许多核苷酸具有可检测标记；(2)在足以允许靶结合区段与靶核酸杂交的条件下，孵育样品和寡核苷酸探针；和(3)检测杂交的寡核苷酸探针上的标记，以检测靶核酸。在一些实施方案中，该方法更进一步包括在检测标记之前除去未杂交的寡核苷酸探针。而且，在不同的实施方案中，用于该检测方法的寡核苷酸探针是如上面所述的任何发夹-标记的寡核苷酸。在另一个实施方案中，使用的探针是如上所述的发夹标记的树枝状聚合体探针。此外，在该方法的某些实施方案中，其中可检测标记是间接标记，检测包括使间接标记与次级标记接触。例如，其中该间接标记是生物素时，间接标记可以是，例如，抗生蛋白链菌素。类似地，其中间接标记是半抗原时，次级标记可以是，例如，标记的抗半抗原抗体。仍然在检测方法的其它实施方案中，靶核酸固定于固体基质上。可选择地，在其它实施方案中，靶核酸在细胞或组织样品中，而且标记的寡核苷酸与靶核酸原位杂交。在某些实施方案中，杂交的寡核苷酸探针上的标记的检测包括液相分析如，例如，包括流式细胞术的分析。本专利技术还提供了一种用于引物延伸的方法，其包括在靶核酸用作模板用于从引物延伸以产生延伸的引物的条件下，使靶核酸与寡核苷酸引物接触，该寡核苷酸引物包含(1)基本上与靶核酸互补的单链靶结合区段和(2)包含茎区域和环区域的发夹结构，其中发夹结构内的两个或多个核苷酸具有可检测标记。在某些实施方案中，该方法还包括在靶核酸用作模板用于从寡核苷酸引物和第二引物扩增以产生扩增产物的条件下，使靶核酸与包含基本上与延伸的引物互补的引发区段的第二引物接触。第二引物可以，例如，包括包含第二茎区域与第二环区域的第二发夹结构，其中第二发夹结构内的至少一个核苷酸具有可检测标记。在包括使用两个发夹标记的引物的某些实施方案中，每个第一和第二引物的发夹结构中至少一个核苷酸被可检测地标记。在引物延伸方法的一些实施方案中，在存在未标记的游离核苷酸时进行扩增。在其它的实施方案中，靶结合区段是随机的(例如，具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种标记的寡核苷酸，其包含：基本上与靶核酸互补的单链靶结合区段；和包含茎区域与环区域的发夹结构，其中发夹结构内的许多核苷酸具有可检测标记。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：PT小莫恩，J特诺夫斯基，
申请(专利权)人：单细胞系统公司，
类型：发明
国别省市：US[]