褐飞虱激素受体基因NLHR3调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段及其应用制造技术

本发明专利技术涉及褐飞虱激素受体基因

Gene fragment of imidacloprid and chlorpyrifos synergistically regulated by the brown planthopper receptor gene NLHR3 and its application

The present invention relates to the brown planthopper receptor gene

【技术实现步骤摘要】
褐飞虱激素受体基因NLHR3调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段及其应用
本专利技术涉及一种褐飞虱激素受体基因NLHR3调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段及其应用，属于生物

技术介绍
据专利技术人所知，褐飞虱Nilaparvatalugens(Stål)属于半翅目，飞虱科，主要分布于亚洲稻区，褐飞虱具有远距离迁飞的习性。褐飞虱是一种仅危害水稻的单食性昆虫。褐飞虱利用本身的刺吸式口器吮吸寄主植物汁液，造成水稻“冒穿”，另外可以传播植物病毒病，如草状丛矮病和齿叶矮缩病等。20世纪80年代以来，褐飞虱在我国的年发生面积为1330-2000万hm2，约占水稻种植面积的50%，年损失稻谷达10-15亿Kg。2005年，褐飞虱在我国南方稻区爆发，引起水稻大面积干枯倒伏，造成严重损失。据浙江省农业厅调查统计，2005年浙江省第5代褐飞虱发生量每667m2达30万头以上的有66.7万hm2，占水稻总种植面积的86%；每667m2在100万头以上的有33.3万hm2，占42%；最高田块的发生量达到每667m21000万头以上；绝收的面积达5333hm2，造成直接水稻产量损失120万吨。2006年台风和降水偏多等气候有利于褐飞虱的迁移和繁殖危害，大部分稻区发生重于2005年同期。近几年，褐飞虱的防治虽然得到重视，但褐飞虱的大发生危害形势依旧严峻。因此，如何通过减少褐飞虱的暴发来增加水稻产量，是目前人类需迫切解决的问题。目前主要以化学农药来防治褐飞虱，已造成褐飞虱对常用各类杀虫剂产生了不同水平的抗性，而导致其频繁暴发。20世纪70年代有机氯杀虫剂由于环境污染、高毒性和高抗性被禁止用于防治稻飞虱。80至90年代部分有机磷杀虫剂和氨基甲酸酯类杀虫剂被应用于稻田，但效果一般、环境相容性差、选择性差。与此同时，作用机制新颖的噻嗪酮、氟虫腈和吡虫啉被相继引入稻田使用，却造成褐飞虱对噻嗪酮和吡虫啉产生高水平的抗性，氟虫腈因对水生生物高毒性于2009年被禁用。抗性监测表明，褐飞虱对现阶段使用的噻虫嗪、烯啶虫胺、毒死蜱、吡蚜酮和醚菊酯类杀虫剂产生了从低到高水平的抗性。鉴于褐飞虱抗药性发生的日益严重，需要开发出施药技术和策略，实现褐飞虱的可持续防治，杀虫剂混用是解决褐飞虱抗药性增强和稻田常用杀虫剂药效下降的有效途径。具有增效作用的杀虫剂混用才是合理的配伍，它可以在有效期内控制有害生物的增长和扩散，延缓有害生物抗性发展、减少施药量及次数和降低成本。混用增效的测定采用活体生物测定技术，目前褐飞虱生测常采用稻苗浸渍法、稻茎浸渍法和点滴法，反映药剂对褐飞虱的毒力，但这种活体生物测定技术的灵敏度较低，影响生测的结果因素较多，导致增效作用的判断产生误差，随着对褐飞虱分子毒理学的深入研究，为建立科学和简便易行的分子检测技术提供前提条件，为杀虫剂混用增效提供精准的评价标准。杀虫剂混用增效检测技术应是基于对褐飞虱抗药性分子机制的研究建立起来。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是广泛存在于动物、植物和微生物中的普遍现象，可以作为防御机制来抵抗体内非正常的核酸。RNA干扰主要是由后转录调控和双链RNA（dsRNA）引起的，压制靶标基因的表达。最近几年，RNAi技术已成为研究基因功能和害虫治理的一种有利用价值的工具。在实际的应用中，通过导入需要沉默的基因的双链RNA（dsRNA）来特异性降解细胞内mRNA，压制靶基因的表达，产生功能表型缺失。目前RNAi可以沉默抗性相关基因，提高昆虫对杀虫剂的敏感性。因此，RNAi为昆虫治理提供了理论依据和技术指导，通过转基因技术可以从实验室向田间实现对害虫的控制，有望从根本上解决这一问题。之前，专利技术人通过研究灰飞虱抗药性分子机制，找出灰飞虱的抗药性基因，并在此基础上通过实施喂食RNAi技术手段来降低灰飞虱抗药性。专利技术人已将研究成果提交了三件专利申请：申请号CN201610432190.3，名称《灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用》的中国专利技术专利申请；申请号CN201610567595.8，名称《灰飞虱抗药性羧酸酯酶基因LSCE12、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用》的中国专利技术专利申请；以及，申请号CN201710290800.5，名称《灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用》的中国专利技术专利申请。如上述专利申请中所言，现有技术利用RNAi技术抗虫的思路主要有两种：第一种是找到害虫的致死基因，然后据此设计合成dsRNA，并通过喂食直接导致害虫死亡、或直接导致害虫不能正常发育和繁殖；第二种是找到害虫的致死基因，然后据此设计转基因农作物，使农作物具备能直接导致害虫死亡的能力。然而，在当前的实际情况下，社会公众对转基因技术普遍带有很深的误解，转基因农作物很难被直接接受；同时，能通过喂食直接导致害虫死亡、或直接导致害虫不能正常发育和繁殖的dsRNA，容易被社会公众误认为该dsRNA本身带有致死毒性、或发育/繁殖毒性，使这种dsRNA也不容易被接受。与之相比，专利技术人利用RNAi技术，通过喂食dsRNA降低害虫抗药性，使害虫更容易被杀虫剂杀灭，可有效避免社会公众产生类似的误解，这无疑会使后续的推广工作更加顺利。目前，专利技术人已将研究目标转向褐飞虱，以期找到褐飞虱中与抗药性相关的调控基因，并以此来指导褐飞虱抗药性的治理。
技术实现思路
本专利技术基于专利技术人的最新研究成果，提供一种褐飞虱激素受体基因NLHR3，利用该基因可获得调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段（即dsRNA），通过喂食RNAi实施调控。同时，本专利技术还提供上述基因片段及其应用。本专利技术解决其技术问题的技术方案如下：褐飞虱激素受体基因NLHR3，其特征是，该基因的序列如SEQIDNO.1所示。该基因的核苷酸序列长度为1761bp，其中，开放阅读框为从5′端第162位到第1721位碱基，编码区长度为1560bq；5′端UTR区从第1位到第161位碱基，3′端UTR区从1722位到1761位碱基。该基因的等电点是6.91，分子重量是57.89kDa。本专利技术还提供：由前文所述褐飞虱激素受体基因NLHR3编码的多肽，其特征是，该多肽的序列如SEQIDNO.2所示。该多肽由520个氨基酸残基组成，其中，极性氨基酸312个，强酸氨基酸（Asp和Glu）57个，强碱氨基酸（Arg和Lys）56个，疏水性氨基酸208个。该多肽的第77-175位氨基酸和第191-411位氨基酸之间分别有一个NR_LBD_ERR和NR_DBD_ERR结构域。采用APSSP2法预测该多肽的蛋白二级结构可知，α螺旋占58.65%，β折叠占3.08%，无规则卷曲占38.27%。本专利技术还提供：调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段，其特征是，该基因片段的序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供：前文所述调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段的合成方法，其特征是，包括以下步骤：第一步、从褐飞虱材料中提取总RNA；所述褐飞虱材料至少包括褐飞虱卵、褐飞虱若虫、褐飞虱成虫之一；第二步、先以褐飞虱总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；再以PCR合成褐飞虱cDNA模板；第三步、采用引物dsNLHR3-F和引物dsNLHR3-R、以及褐飞本文档来自技高网...

【技术保护点】
褐飞虱激素受体基因

【技术特征摘要】
1.褐飞虱激素受体基因NLHR3，其特征是，该基因的序列如SEQIDNO.1所示。2.由权利要求1所述褐飞虱激素受体基因NLHR3编码的多肽，其特征是，该多肽的序列如SEQIDNO.2所示。3.调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段，其特征是，该基因片段的序列如SEQIDNO.3所示。4.权利要求3所述调控吡虫啉和毒死蜱协同增效的基因片段的合成方法，其特征是，包括以下步骤：第一步、从褐飞虱材料中提取总RNA；所述褐飞虱材料至少包括褐飞虱卵、褐飞虱若虫、褐飞虱成虫之一；第二步、先以褐飞虱总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；再以PCR合成褐飞虱cDNA模板；第三步、采用引物dsNLHR3-F和引物dsNLHR3-R、以及褐飞虱cDNA模板进行PCR扩增，获得dsRNA模板并进行纯化；其中，所述引物dsNLHR3-F的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQIDNO.5所示序列，所述引物dsNLHR3-R的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQIDNO.6所示序列，所述T7启动子序列如SEQIDNO.7所示；第四步、采用纯化后的dsRNA模板，体外合成dsRNA并保存备用；所得dsRNA即为目标基因片段。5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征是，第一步的具体过程为：采用总RNA提取试剂盒从褐飞虱材料中提取褐飞虱总RNA；以琼脂糖凝胶电泳纯化褐飞虱总RNA；以核酸蛋白定量仪检测褐飞虱总RNA的浓度以及吸光度值；将褐飞虱总RNA冻存；第二步的具体过程为：以褐飞虱总RNA为模板，采用反转录试剂盒合成cDNA第一链；然后，采用cDNA第一链，于PCR仪中合成褐飞虱cDNA模板，具体合成条件为：37℃15min，85℃5s，12℃保持；所得褐飞虱cDNA模板冻存；第三步的具体过程为：采用引物dsNLHR3-F和引物dsNLHR...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐鹿，赵钧，顾中言，徐德进，许小龙，徐广春，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32