本发明专利技术根据猪蓝耳病病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲型标准毒株（ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２）的ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７的序列，设计一对猪蓝耳病病毒特异性扩增引物，结合先进的病毒核酸提取技术和高效ＲＴ－ＰＣＲ商品试剂，经实验条件优化，组合而成的一种成熟的一步法ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒。该试剂盒能对待检组织进行直接检测，检测过程简单，抗污染性强。从病料处理到获得结果只需４小时，结果准确且灵敏度高、特异性好，是目前猪蓝耳病病毒检测方法非常好的一种替代方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兽医生物
的诊断技术，具体是一种检测猪蓝耳病病毒的诊断方法和 专用试剂盒。背彔技术猪蓝耳病，也称为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪蓝耳病病毒(PRRSV)引起的一种猪的传染病，其临诊特征为各种年龄的猪均 可感染，病猪厌食、嗜睡、体温升高，妊娠母猪发生早产、流产、死胎、弱胎和木乃伊胎， 种公猪性功能下降，仔猪和育肥猪呼吸障碍。其特征性病理变化为间质性肺炎，皮肤发绀。 l诉7年该病首次报道于美国，随后迅速蔓延北美、欧洲及亚洲各国，目前也是我国最主要的 猪群疫病之一。PRRS与其它引起猪繁殖障碍的疾病存在着非常类似的临诊症状，没有示病性 临床症状，根据临床症状进行诊断及鉴别诊断比较困难。实验室诊断方面，国内外已建立了 一些常规的检测方法，如病毒的分离与鉴定、间接ELISA、 IPMA、 IFA及Dot - ELISA等血 清学方法用于该病诊断。在这些诊断方法中，特异性、敏感性、操作技术等方面存在各种各 样的问题,不能满足生产需要。由于该病特殊的免疫机理，疫苗免疫效果的不确定性，对养猪 业的威胁将时长期存在，因此，淘汰病原学阳性猪是该病防疫中主要措施，建立病原学快速 检测技术非常重要。
技术实现思路
本专利技术根据猪蓝耳病病毒(PRRSV)美洲型标准毒株((ATCC VR—2332)的ORF6及部分 ORF7的序列，设计一对猪蓝耳病病毒特异性扩增引物，结合先进的病毒核酸提取技术和高 效RT-PCR商品试剂，经实验条件优化，组合而成的一种成熟的一步法RT-PCR检测试剂盒。 该试剂盒能对待检组织进行直接检测，检测过程简单，抗污染性强。从病料处理到获得结果 只需4小时，结果准确且灵敏度高、特异性好，是目前猪蓝耳病病毒检测方法非常好的一种 替代方法。本专利技术的主要技术方案有1.引物设计根据猪蓝耳病病毒(PRRSV)美洲型标准毒株((ATCCVR-2332)的ORF6及 部分ORF7的序列，设计一对猪蓝耳病病毒特异性扩增引物，引物详细为Primer PI: 5，一 CACTACGGTCAACGGCACAT—3，Primer P2: 5，一 CCACAGTGTAACTTATCCTCCCT—3，其中PrimerPl/P2引物对在猪蓝耳病病毒核酸中特异性扩增出402bp的产物。2. 待检病料的核酸提取采用RNA快速提取方法提取待检组织样品的RNA核酸。3. RT-PCR体系AMV/Tfl 5xReaction Buffer 2.5/xL， 25mM/L MgS04 1/*L， 10mM/L dNTP0. 5.tL， AMV Rever Transcriptase 2.5u， Tfl DNA Polymerase 2,5u 20uM/L Primer PI l/tL， 20uM/L Primer P2 1/iL,待检RNA模板5/iL,加水至总体积25/iL。4. RT-PCR程序45r逆转录45min; 94X:预变性2min; 94"30s、 55"C45s、 68XM5s， 35个循环；最后68^C延伸8min。 4匸保存。本专利技术试剂盒组成及保存Sloution R2 6mL x 1管 室温储存Wash buffer 12mLxi管 室温储存Elution buffer lmLx 1管 室温储存 Spin columns 10个 室温储存RNaseFree离心管20个 室温储存 RT-PCR体系 20pLxlO管-20X:储存，避免反复冻融。阳性对照 lipLxl管 -20匸储存，避免反复冻融。RNase Free H20lmL x 1管 -20"储存 本试剂盒有效期6个月。 本专利技术的优点1. 操作简单，抗污染性强，耗时短。本方法采用了先进的病毒核酸提取技术，操作 简单，可操作性强，并省去了以往抽提核酸过程中的多步骤、多试剂抽提，从而减 少了污染，保证了检测结果的准确度；同时，采用的高效RT-PCR商品试剂，实现了 一步法检测，比常用的二步法RT-PCR省时省力，同时也避免了二步法RT-PCR过程 中加样所造成的PCR污染。2. 特异性强、重复性好、灵敏度高。本试剂盒仅对猪蓝耳病病毒的核酸有扩增产物， 对猪伪狂犬病病毒、圆环病毒、乙型脑炎、猪瘟病毒、未接种PRRSV的正常细胞培 养液的核酸无扩增产物；对猪蓝耳病弱毒疫苗株和猪蓝耳病病毒阳性病料的检测结 果重复性100%;对经104倍稀释的临床阳性病料的核酸提取液有稳定准确的检测结 果。附图说明图1、引物Primer PI 、 PrimerP2的序列图2、试剂盒同时对猪伪狂犬病病毒(l泳道)、圆环病毒(2泳道)、乙型脑炎(3泳道)、猪 瘟病毒(4泳道)、未接种PRRSV的正常细胞培养液(5泳道)、PRRSV弱毒疫苗株(6 泳道)、灭菌水(7泳道)进行检测的电泳结果，M泳道为DNADL2000Marker (2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp)图3、本试剂盒对部分样品的检测结果图本专利技术的具体实施例方式1. 样品制备1.1组织样品剪取待检组织0.5g置研磨器中剪碎并研磨，加入L5mLPBS (pH7.2)继续研 磨；将研磨好的待检组织液，置1.5mL灭菌离心管中，5000rpm离心l~2min，取上清100/iL 进行核酸提取。1.2血清样品直接取100/tL进行核酸提取。 1.3阳性对照直接取100ML进行核酸提取。 1.4阴性对照直接取100j^LRNase Free H20进行核酸提取。2. 操作步骤2.1在100/iL处理好的样品中，加入Sloution R2溶液600/*L，充分颠倒混匀，室温静置3~5min。 2.2吸取上清液至Spin column, Spin column要套上离心管，12000rpm离心30s。 2.3弃去外套管中的液体，向Spin column中加入600/*L Wash buffer, 12000rpm离心30s。 2.4重复2.3。 12000rpm离心2min。2.5将Spin column移入新的RNase Free离心管内，在膜中央加入Elution buffer 3O~50/iL，室温静置2 3min, 12000rpm离心2min，获得样品总RNA。2.6取5/iL样品RNA，加入至RT-PCR体系中，混勾，6000rpm离心30s。2.7置于PCR仪中，进行如下程序45C逆转录45min; 94"C预变性2min; 94*C30s、 55"45s、68XM5s， 35个循环；最后68X:延伸8min。 4'C保存。2.8取8/iLPCR产物，混合1^L上样缓冲液，1 1.5。/。的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以 DNA分子量Marker为参考。2.9在阴性对照无产物、阳性对照有明显402bp条带的前提下，样品出现402bp大小条带定 为PRRSV核酸阳性。权利要求1.一对猪蓝耳病病毒(猪繁殖与呼吸综合征病毒，porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)特异性检测引物Primer 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一对猪蓝耳病病毒（猪繁殖与呼吸综合征病毒，ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ，ＰＲＲＳＶ）特异性检测引物Ｐｒｉｍｅｒ Ｐ１／Ｐ２，其序列为： Ｐｒｉｍｅｒ Ｐ１：５’－ＣＡＣＴＡＣＧＧＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＴ－３’ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐ２：５’－ＣＣＡＣＡＧＴＧＴＡＡＣＴＴＡＴＣＣＴＣＣＣＴ－３’ 其中Ｐｒｉｍｅｒ Ｐ１／Ｐ２引物对在猪蓝耳病病毒核酸中特异性扩增出４０２ｂｐ的产物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘道新，邱伯根，李晓成，陈杰，谈志祥，邱立新，鲁杏华，范仲鑫，何世成，
申请(专利权)人：湖南省兽医总站，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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