本发明专利技术根据Ｇｅｎｂａｎｋ上的猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）变异株（高致病性猪蓝耳病病毒）的核苷酸序列与古典美洲株ＰＲＲＳＶ的核苷酸序列，设计一对高致病性猪蓝耳病病毒的特异性检测引物，结合先进的病毒核酸提取技术和高效ＲＴ－ＰＣＲ商品试剂，经实验条件优化，组合而成的一种成熟的一步法ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒。该试剂盒能对待检组织进行直接检测，检测过程简单，抗污染性强。从病料处理到获得结果只需４小时，结果准确且灵敏度高、特异性好，是目前高致病性猪蓝耳病病毒检测方法非常好的一种替代方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兽医生物
的诊断技术，具体是一种检测高致病性猪蓝耳病病毒的诊 断方法和专用试剂盒。
技术介绍
猪蓝耳病，也称为猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪蓝耳病病毒(PRRSV)引起的一种猪的传染病，其临诊特征为各种年龄的猪均 可感染，病猪厌食、嗜睡、体温升高，妊娠母猪发生早产、流产、死胎、弱胎和木乃伊胎， 种公猪性功能下降，仔猪和育肥猪呼吸障碍。其特征性病理变化为间质性肺炎，皮肤发绀。 1987年该病首次报道于美国，随后迅速蔓延北美、欧洲及亚洲各国。在我国，郭宝清等于 1996年从北京地区分离到了PRRSV，首次证实了PRRS在我国的存在，随后许多省市也陆续 报道了该病的发生。2006、 2007年猪"高热病"席巻了我国的大部分省区，给养猪业造成了 巨大的经济损失，其主要病原之一就是变异了的猪篮耳病病毒，也称为高致病性猪蓝耳病病 毒。相较于其它PRRSV毒株，高致病性猪蓝耳病病毒有更高的致病性，其能产生100%仔猪 发病率和50%以上的死亡率。目前，检测高致病性猪蓝耳病病毒的主要方法有病毒分离、过 氧化物酶单层试验(IPMA)和RT-PCR诊断方法。病毒分离和过氧化物酶单层试验技术要求 较高，'耗时长，操作复杂，很难在实验室广泛应用。由中国动物疫病预防控制中心研发的高 致病性猪蓝耳病病毒RT-PCR检测试剂盒目前被广泛应用于全国的临床检测实验室，有稳定 而权威的检测准确性，但该试剂盒采用常规的核酸提取试剂，操作步骤多，容易造成提取过 程中的RNA污染或降解，其两步法RT-PCR检测也给实验带来一定的污染风险，并延长了实 验时间。
技术实现思路
本专利技术根据Genbank上的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(高致病性猪蓝耳 病病毒)的核苷酸序列与古典美洲株PRRSV的核苷酸序列，设计一对高致病性猪蓝耳病病 毒的特异性检测引物，结合先进的病毒核酸提取技术和高效RT-PCR商品试剂，经实验条件 优化，组合而成的一种成熟的一步法RT-PCR检测试剂盒。该试剂盒能对待检组织进行直接 检测，检测过程简单，抗污染性强。从病料处理到获得结果只需4小时，结果准确且灵敏度 高、特异性好，是目前高致病性猪蓝耳病病毒检测方法非常好的一种替代方法。本专利技术的主要技术方案有 1. 引物设计根据Genbank上的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(高致病 性猪蓝耳病病毒)的核苷酸序列与古典美洲株PRRSV的核苷酸序列，设计一对高致 病性猪蓝耳病病毒的特异性检测引物，引物详细为Primer PI: 5' — CGTAGAACTGTGAC AACAAC _ 3 ， Primer P2: 5' — TGAGTATTTTGGGCGTGTGAT—3'其中PrimerPl/P2引物对在猪蓝耳病病毒核酸中特异性扩增出252bp的产物。2. 待检病料的核酸提取采用RNA快速提取方法提取待检组织样品的RNA核酸。3. RT-PCR体系AMV/Tfl 5xReaction Buffer 2.5]HL, 25mM/L MgS04 1/iL, 10mM/L dNTP 0.5juL, AMV Rever Transcriptase 2.5u, Tfl DNA Polymerase 2.5u, 20uM/L Primer PI 1 pL, 20uM/L Primer P2 lpL,待检RNA模板5 u L，加水至总体积25 u L。4. RT-PCR程序45。C逆转录45min; 94。C预变性2min; 94°C30s、 52。C45s、 68。C45s， 35个循环；最后68'C延伸8min。 4'C保存。本专利技术试剂盒组成及保存Sloution R7.5mL x 1管室温储存Wash buffer15mLx 1管室温储存ELution bufferlmL x 1管室温储存Spin coLumns12个室温储存RNaseFree离心管24个室温储存RT-PCR体系20juL x 10管-2crc储存，避免反复冻融。阳性对照lmLxl管-20"储存，避免反复冻融。RNase Free H20lmLxl管-20'C储存本试剂盒有效期6个月。本专利技术的优点1. 操作简单，抗污染性强，耗时短。本方法采用了先进的病毒核酸提取技术，操作简单， 可操作性强，并省去了以往抽提核酸过程中的多步骤、多试剂抽提，从而减少了污染，保证了检测结果的准确度；同时，采用的高效RT-PCR商品试剂，实现了一步法检测， 比常用的二步法RT-PCR省时省力，同时也避免了二步法RT-PCR过程中加样所造成的 PCR污染。2. 特异性强、重复性好、灵敏度高。本试剂盒仅对高致病性猪蓝耳病病毒的核酸有扩增 产物，对猪瘟病毒兔源弱毒株、猪瘟野毒阳性样品(ELISA检测阳性)、普通蓝耳病弱 毒株、AIV琼脂扩散抗原、灭菌生理盐水的核酸无扩增产物；对高致病性猪蓝耳病病毒 阳性病料的检测结果重复性100%;对经10万倍稀释的临床阳性病料的核酸提取液有稳定准确的检测结果。 附图说明图1、引物Primer PI 、 PrimerP2的序列图2、试剂盒同时对经1()0 105梯度稀释的临床阳性样品进行检测的电泳结果，泳道自左向 右分别为M、 10。、 101、 102、 103、 104、 105、阴性对照；M泳道为DNADL2000 Marker (自上而下分别为2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp)图3、本试剂盒对部分样品的检测结果图本专利技术具体实施例方式1. 样品制备1.1组织样品剪取待检组织0.5g置研磨器中剪碎并研磨，加入1.5mlPBS (pH7.2)继续研 磨；将研磨好的待检组织液，置1.5mL灭菌离心管中，5000rpm离心l-2min，取上清100/iL进行核酸提取。1.2血清样品直接取100ML进行核酸提取。 1.3阳性对照直接取100ML进行核酸提取。 1.4阴性对照直接取100/xL RNase Free H20进行核酸提取。2. 操作步骤2.1在IOOmL处理好的样品中，加入Sloution R2溶液600pL，充分颠倒混匀，室温静置3-5min。 2.2吸取上清液至Spin column, Spin column要套上离心管，12000rpm离心30s。 2.3弃去外套管中的液体，向Spin column中加入600/iL Wash buffer, 12000rpm离心30s。2.4重复2.3。 12000rpm离心2min。2.5将Spin column移入新的1.5mL离心管内，在膜中央加入Elution buffer 30~50|tiL，室温静置2 3min， lOOOOrpm离心2min，获得样品总RNA。 2.6取样品RNA，加入至RT-PCR体系中，混匀，6000rpm离心30s。 2.7置于PCR仪中，进行如下程序45'C逆转录45min; 94'C预变性2min; 94°C30s、 52°C45s、68。C45s， 35个循环；最后68。C延伸8min。 4'C保存。 2.8取8/xLPCR产物，混本文档来自技高网...
【技术保护点】
一对高致病性猪蓝耳病病毒（高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，ｈｉｇｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ，ＨＰ－ＰＲＲＳＶ）特异性检测引物Ｐｒｉｍｅｒ Ｐ１／Ｐ２，其序列为： Ｐｒｉｍｅｒ Ｐ１：５’－ＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＣＡＡＣ－３’ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐ２：５’－ＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧＴＧＡＴ－３’ 其中Ｐｒｉｍｅｒ Ｐ１／Ｐ２引物对在高致病性猪蓝耳病病毒核酸中特异性扩增出２５２ｂｐ的产物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何世成，范仲鑫，刘道新，谈志祥，邱立新，鲁杏华，唐小明，黄建龙，
申请(专利权)人：湖南省兽医总站，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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