本发明专利技术提供了用于猪瘟病毒实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测的探针和引物序列，以及一种包括该探针和引物序列的试剂盒。利用该试剂盒及荧光定量ＰＣＲ的原理，建立了动物及动物源性食品中猪瘟病毒的实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，并从敏感性、特异性等方面进行了比较研究。此检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作简单、检测速度快、不受操作人员主观意识影响，同时检测样品通量大、生物安全风险低等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测的探针、引物序列，以及一种包 括该探针和引物的试剂盒。
技术介绍
猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever vims CSFV)引起的一种急性、热性、 高度接触性传染病，它的特点是发病快、流行范围广、死亡率高。不仅给养猪业造成极大 的经济损失，而且严重阻碍猪及猪产品的国际贸易，OIE将其列为A类传染病，FAO和各 国政府也将其列为需要严密监控和检疫的主要动物传染病之一。目前国内传统的CSFV实验室检验方法主要包括(1)荧光抗体试验，此方法敏感性 不高，不能有效地检测低病毒含量的临床样品和动物源性食品中CSFV的存在，同时受荧 光抗体质量及操作人员主观意识影响较大；(2)抗原捕获ELISA (AC-ELISA)，该方法具 有快速、操作简单等特点，但敏感性较低，同时特异性也不强，不能有效地区分BVDV、 BDV、 CSFV; (3)病毒分离，此方法具有敏感性高，特异性较强，但存在技术要求高、检 验周期长、检验过程中生物安全隐患较大等缺点，并需要借助其它方法(如荧光抗体方法) 才能进行判定；(4)荧光抗体病毒中和试验，该方法为国际贸易指定的方法，主要用于样 品中CSFV抗体检测，但不能有效地区分免疫猪群和感染猪群；(5)过氧化物酶联中和试 验，这是国际贸易指定方法，该方法在抗体稀释倍数较低时不能有效地区分BVDV、 BDV、 CSFV; (6)酶联免疫吸附试验，该方法检验速度快、操作简单，但特异性和敏感性取决于 试剂抗体的特异性。与此同时，后三种方法只适用于猪血清样品中CSFV抗体检测，不适 用临床组织样品和动物源性食品中CSFV抗原检测。动物源性食品(Animal Derived Food)是指全部可食用的动物组织以及蛋和奶，包括 肉类及其制品(含动物脏器)、水生动物产品等。随着现代分子生物技术在动物疫病实验室检验工作的广泛应用，目前已经建立了单管 反转录套式RT-PCR、巢式PCR方法来替代抗原捕获-ELISA和病毒分离技术，国内外有关 部门也相继建立了 CSFV实时荧光定量PCR检测技术，该技术是根据CSFV基因组结构特 点，选择5'非编码区设计一对特异性引物和荧光探针，利用荧光定量PCR的原理，建立动物及动物源性食品中CSFVreal-time RT-PCR方法。该方法主要由一条两端标记有荧光基团 的探针和一对引物组成，在探针完整时，两基团在空间结构上互相靠近，5'报告基团产生 的荧光基团为荧光共振能量而被3'端淬灭基团淬灭，因此体系中没有荧光信号的产生，在 PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用 5'—3'外切活性对探针进行切割，释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量 转移，报告基团所释放的荧光可以被荧光PCR仪器内的光学系统检测出来，荧光量的增加 与PCR的产物的积累量呈正比例关系。而PCR产物的积累与初始模板数成正线性关系， 因此在PCR循环数相同的情况下，荧光量与初始模板数成正线性关系。因此可以推论出达 到相同的荧光阈值(Ct)值与初始模板数的对数成负线性相关，这就是荧光定量PCR实现 定量的原理。这种方法与传统的检测方法相比，荧光定量PCR方法特异性好，因为检测过 程中上下游引物与探针同时保证了检测方法的特异性，而且探针与模板结合要求特异性更 强。其中的荧光修饰基团有多种。CSFV real-time RT-PCR方法在实验感染样品、猪瘟疫苗弱毒株等样品中得到了较好地 应用。所使用的PCR引物和探针是针对CSFV某一特定区域的基因组序列进行设计，能有 效地区分被检样品中的BVDV、 BDV、 CSFV，但该技术并未在动物临床样品和动物源性食 品中CSFV得到应用，其敏感性和特异性也有待进一步提高。
技术实现思路
本专利技术提供了一种特异性、灵敏度高的用于猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测的探 针，其序列为5'-tgatgggggtacgacctgatagggt- 3'。本专利技术还提供了与上述探针相应的引物，其序列为5'—gacacaagcgcaggcaatag-3'和5 -agtgggttccaggartacat-3'。本专利技术还提供一种猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其中包括上述探针 和引物，具体包括1)阳性对照阳性标准品采用人工合成的含有目的检测基因的RNA作为标准样品，共4瓶，300W/瓶，-20'C冷冻保存；标准品l: 107拷贝/5!4;标准品2: 105拷贝/5)4;标准品3: 103拷贝/5|^1;标准品4: 10'拷贝/5W;2)阴性对照采用无猪瘟病毒感染猪组织，按1:5倍体积加入0.1。/。DEPC水，于组织 匀浆器中充分研磨，然后3500rpm离心20min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水，分装成300ri/瓶，-2(rc冷冻保存备用；3)0.1。/。DEPC水在去离子水中加入0.1%焦碳酸二乙酯，室温下过夜处理，15磅30 分钟，2X10ml/瓶；4) Trizol裂解液50ml/瓶，棕色瓶分装，4'C保存备用；5) RT-PCR反应液每个反应包括5XPCR buffer 5. 0W、 10誦oldNTPs 0. 5W、 25腿o1 MgCl2 以及权利要求3所述的引物对各0.514，共8.514， 50个反应体系共计42514;6) 反应酶每个反应体系包括Reverse Transcriptase 0.214、 Taq DNA聚合酶0.5Ml，含 量为3UA4，共0.7W， 50个反应体系共计35rt， -20。C冷冻保存备用；7) 探针溶液探针采用5'-FAM和3'-TAMRA修饰，合成后采用0.1%DEPC水稀释， 浓度为10taiol/L，每个反应体系0.5W， 50个反应体系共计25W， -20'C冷冻保存备用。本专利技术也提供了一种利用上述试剂盒对猪瘟病毒进行实时荧光定量RT-PCR的检测方 法，具体的检测过程为1) 样品的采集与前处理采样过程中样本不得交叉污染，采样器具均采用高压灭菌处理，采样及样品前处理过 程中须戴一次性手套。 a活猪的采样方法采血取用肝素钠处理的一次性采血针管，选取猪耳静脉，按常规的采血方法采集 抗凝血样。b组织、脏器、盐渍肠衣、腌肉、分割肉等样品的采样方法研钵的处理将洗净的研钵用O. 1% DEPCH20处理，高压灭菌风干后备用。 石英砂的处理取适量的石英砂置于灭菌的玻璃瓶中，加入适量的O. P/。DEPCH20处理，高压灭菌风干后备用。用无菌的剪刀、镊子取待检样品2.0g于研钵，剪碎后加入少量的石英砂，充分研磨，再加10ml0.1。/。DEPC水混匀，3000g离心10min后，上清液转入灭菌处理的玻璃管备用。采集或处理的样本在2 8'C条件下保存应不超过24h，长期保存须在-70'C以下，但尽可能避免反复冻融。将采集的样品密封并编号，以冷藏方式尽快送实验室进行检测，如暂不进行检测，必 须冷冻保存。血液样品冷藏保存，保存时间一般不超过7天。2) CSFVRNA的制备样品制备应在生物洁净工作室或生物安全柜内进行。取n个1.5ml经0. 1% DEPC 1120处 理的E本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于猪瘟病毒实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测的探针，其序列为５’－ｔｇａｔｇｇｇｇｇｔａｃｇａｃｃｔｇａｔａｇｇｇｔ－３’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄萍，朱中武，龙新平，黄志强，唐连飞，鲁杏华，黄辉，胡宇东，
申请(专利权)人：黄萍，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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