霉病霉素的生产方法技术

霉病霉素，在农业和园艺中用作抗菌剂，杀菌剂或杀螨剂，通过在培养基中培养属于链轮丝菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ），并且对丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸有抗性的产霉病霉素菌株，可以工业上便利地生产霉病霉素．上述培养基最好至少含有３毫摩尔的Ｎ－甲基化合物或／和含有５－羟甲基胞嘧啶，以促使所说菌株的合成积累霉病霉素，并从所得培养液中回收霉病霉素．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术与生产霉病霉素的发酵方法有关。霉病霉素是一具有结构式〔Ⅰ〕的化合物;通过培养属于链轮丝菌 属产霉病霉素的菌株，它作为抗菌素首次被发现并命名为“抗菌素B-98891”。我们把注意力集中在它的活性上，特别是它作为多种植物的一种预防和治疗白粉病药或作为杀螨剂的作用。因此，希望提高霉病霉素的产量，包括在至少含3毫摩尔(毫摩尔/升)N-甲基化合物培养基上或含5-羟甲基胞嘧啶的培养基上培养产霉病霉素的菌株的发酵方法。〔U.S.P.4007267;U.S.P.4334022;U.S.P.4296107;英国专利号1507193;“抗菌素杂志”31卷，6期511-518页，519-524页(1978);“杀虫剂科学杂志”4卷3期，349-353页(1979);“四面体化学”37卷，1317-1327页(1981);等等〕。然而，就目前所知的生产霉病霉素的发酵方法，所采用的产霉病霉素菌株生产霉病霉素的能力是有限的，因而通过改进培养基中含有的物质来提高霉病霉素的产率也是限制的，因此这些方法已不能满足工业化大规模地生产霉病霉素的需要。本项专利技术的专利技术者经过对提高菌株产霉病霉素能力勤奋研究，结果发现;当把产霉病霉素的菌株对具有结构式 〔Ⅱ〕的丝氨酸氧肟酸盐或对具有结构式 〔Ⅲ〕的刀豆氨酸有抗性时，即便使用普通培养基，菌株生产霉病霉素的能力也得到意想不到的提高，从而使霉病霉素的生产效率变得更高。根据这一发现，完成了本项专利技术。更准确地说，本专利技术是关于(1)一种生产霉病霉素的方法，其特征在于通过在培养基上培养属于链轮丝菌属，产霉病霉素的菌株，由于此菌株抗培养基中的丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸，从而引起所说菌株合成和积累霉病霉素，并从最后培养物液中回收霉病霉素。(2)上述申请专利(1)所述的生产霉病霉素的方法，其特征在于培养基中至少含有3毫摩尔的N-甲基化合物。(3)申请专利(1)或(2)所述的生产霉病霉素的方法，其特征在于培养基中含有5-羟甲基胞嘧啶。(4)裂生链轮丝菌(Streptoverticillium rimofaciens)能抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸并能产生霉病霉素。在本专利技术制备霉病霉素的方法中，应用的是属于链轮丝菌属，有抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸特性的产霉病霉素的菌株(这里或以后称“本专利技术菌株”)。举例来说，本专利技术菌株有如下特性〔1〕形态学特性在各种不同的常规培养基上，本专利技术菌株形成气生菌丝，呈轮状具二级轮枝。在合成琼脂培养基如，葡萄糖、天冬酰胺琼脂上虽然很少但也能发现孢子丝环和钩状孢子丝。孢子形状为卵形到园筒形，大小为0.6～0.8×0.7～1.3微米。一般孢子产生呈链状，含3到16个，每个孢子表面光滑或瘤状。在常规培养基上，没有观察到孢子囊、鞭毛、菌核等等。〔2〕培养特性本专利技术菌株的培养特性如表1所示。如无特殊说明，描述的是在28℃下经21天培养后的结果。表中用括号()表明的颜色名称是根据《色谱手册》，第4版，Container Corporation of America。〔3〕生理特性(1)生长温度范围在15～38℃范围内生长，更好地生长和产生气生菌丝的温度为28～36℃。(2)明胶液化(24℃培养28天)不液化。(3)淀粉水解阳性(4)硝酸盐还原在细菌硝酸盐培养液(ISP-No.8)和查氏培养液(Czapek′s solution)中阴性。 (5)脱脂乳凝固反应阳性蛋白胨化阳性(6)黑色素的产生阳性(蛋白胨、酵母液、铁离子琼脂培养基)阴性(酪氨酸琼脂培养基)(7)碳源的利用(在Pridham·Gottlieb琼脂培养基上)ⅰ)利用相当好的碳源肌醇、D-半乳糖、D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露糖、淀粉、甘油、醋酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠。ⅱ)一般利用的碳源D-果糖、海藻糖。ⅲ)不利用的碳源赤藓醇、核糖醇、D-山梨醇、D-甘露醇、半乳糖醇、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-山梨糖、鼠李糖、蔗糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖、水杨苷、七叶苷、菊粉。(8)在蛋白质培养基上的色素生成弱(9)肉汤-琼脂培养基上的裂化无(10)对丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸的抗性抑制菌丝生长的最低浓度;抗丝氨酸氧肟酸盐至少是40微克/毫升，抗刀豆氨酸至少是100微克/毫升。〔4〕其它特性按照“发酵工程杂志”63卷，1期，17-21页(1985)上描述的酶学方法，产生5-羟甲基胞嘧啶的比活力为0.18毫微摩尔/分/毫克蛋白或更大。具有上述特性的这个菌株是裂生链轮丝菌，例如裂生链轮丝菌CR3-182(抗丝氨酸氧肟酸盐)，裂生链轮丝菌CVR-48(抗丝氨酸氧肟酸盐和刀豆氨酸)和裂生链轮丝菌CVR-16(抗刀豆氨酸)。上述裂生链轮丝菌CR3-182已于1985年6月28日保藏大阪发酵研究所(IFO)，保藏号为IFO-14448，同时于1985年7月8日把它保藏在工业科学和技术局的发酵研究所(FRI)，保藏号为FERM P-8334，裂生链轮丝菌CVR-48 1985年6月28日保藏在IFO，保藏号为IFO-14449，1985年7月8日保藏在FRI，保藏号为FERM P-8333，裂生链轮丝菌CVR-16于1986年7月15日保藏在IFO，保藏号为IFO-14527，1986年7月25日保藏在FRI，保藏号为FERMP-8874。在生产霉病霉素这个方法的菌株培养中，可利用通常微生物可吸收的碳源，易消化的氮源和无机盐等等组成的培养基。如需要时，培养基中可加入微量营养物，生长促进剂，前体和其它少量就能起作用的物质。通常可同化的碳源包括，如淀粉、糊精、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、玉米浆、谷子凝胶，以及有机酸如醋酸、琥珀酸等等或脂肪和油或多羟基醇如甘油，这些物质可单独用或联合应用。易消化的氮源包括无机硝酸盐如各种铵盐、硝酸盐和尿素以及有机的天然物质如酵母浸出液，酪素，肉汁、棉籽粉、玉米浆、豆粉等等，它们既可单用也可以联合使用。当需要时培养基还包含有无机盐、铁、镁、锰、钴、铜、钠、钾、钙、锌等金属盐。此外如果有必要用的微生物的话，则培养基中应含有适量的特殊营养物，如氨基酸、维生素、核酸碱基等等物质。只要能达到本专利技术的目的这些外加物的浓度没有特别限定，可从常规发酵过程一般使用的范围中适当选出合适浓度。为了获得霉病霉素较高的产量，最好使N-甲基化合物组合在培养基中。这种N-甲基化合物可包括在其分子中具有不少于1个可被1个到4个甲基取代氮原子。较好是在分子中有1个被1个或多个甲基取代的那些化合物，特别是具有三甲基氨基基团(其中氮原子被3个甲基取代，即 的季铵盐最好。另外，在培养基中具有一个基团能转化成N-OH3基团的化合物，如，N1N-甲撑双丙烯酰胺，也能用作为所说的N-甲基化合物。N-甲基化合物通常分子量在50-1000范围内，最好在90-130范围内。N-甲基化合物可以是水溶性或水不溶的，但易水溶性的N-甲基化合物应用较为有利。这种N-甲基化合物的实例有;N-甲基酸酰胺，N-甲基氨基化合物、N-甲基胺、N-甲基铵化合物、N1N-甲基双丙烯酰胺等等。N-甲基酸酰胺类有，例如N1N-二甲基乙酰胺，N-甲基-丙烯酰胺等等，N-甲基氨基化合物有，例如，N-甲基尿素，1，1，3，3-四甲基尿素，2-二甲基氨基乙醇等等;N-甲基胺有例如，三甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产霉病霉素的方法，特征在于培养属于链轮丝菌属和对培养液中的丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸有抗性的菌株，促使所说菌株合成和积累霉病霉素，并从所得的培养物液中回收霉病霉素。

【技术特征摘要】
JP 1986-7-29 178402/86;JP 1985-8-20 183343/851.生产霉病霉素的方法，特征在于培养属于链轮丝菌属和对培养液中的丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸有抗性的菌株，促使所说菌株合成和积累霉病...

【专利技术属性】
技术研发人员：田秀和，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]