用载体转化骨髓瘤细胞生产肽的方法技术

一种用转化哺乳动物细胞和培养转化细胞生产所需的肽的方法可以通过用骨髓瘤细胞作为哺乳动物细胞和／或用具有ＳＶ４０早期启动区顺序的载体予以改进，该启动区顺序位于所需的肽编码基因的５＇末端上行链上和３＇末端下行链上．（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及应用遗传工程技术生产肽的方法、用于生产肽的重组质粒和用该重组质粒转化的动物细胞。关于用转化动物细胞和培养转移基因接受体来生产肽已经作了各种尝试。其中的实例与近似的计算产率一并阐述如下。1.BPV(牛乳头状瘤病毒)小鼠C127系统人体IFN-γ基因(cDNA)，SV40早期启动区;3×105单位/毫升(R.Fukunaga等，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA.81，5086(1984));2.SV40-CV-1系统人体IFN-β基因(cDNA)，SV40早期启动区;2×104单位/毫升(D.Gheysen等，J.Mol.Appl.Genetics，1，305(1982));3.SV40-COS系统人体胰岛素基因(cDNA)，SV40早期启动区(O.Laud等，J.Biol.Chem.，258，6043(1983));4.Eco-gpt-CHO系统人体IFN-γ基因(cDNA)，SV40早期启动区;1×104单位/毫升(T.Kadotani等，Seikagaku，56，915(1984));和5.dhfr-CHO系统人体IFN-γ基因(cDNA)，SV40早期启动区;1×105单位/毫升(S.Scahill等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，4654(1983))。尽管这些方法中每个方法都有其特点，但每个方法仍然都不能令人满意，特别是在所需要的肽的产率方面更是如此。在生产单克隆抗体肽方面，骨髓瘤已用作产生抗体的细胞，然而将他们用于生产其他肽方面至今仍无所知。本专利技术涉及用转化的动物细胞，特别是骨髓瘤细胞生产肽的方法，包括转化细胞和培养转化细胞。在一个实施例中，本专利技术尤其涉及生产所需肽的方法，包括用重组体质粒作为载体转化哺乳动物的细胞，该重组体质粒在所需的肽的编码基因的5′末端上行链和3′末端下行链两者上都具有SV40早期启动区顺序，然后培养由此转化的哺乳动物细胞。在另一实施例中，本专利技术涉及大量生产所需肽的方法，包括用重组体质粒作为载体转化骨髓瘤细胞，该重组体质粒在用于所需要的肽编码基因的5′末端上行链和3′末端下行链两者上都具有SV40早期启动区顺序。骨髓瘤细胞的优点在于，他们具有在体内和体外迅速生长的能力，他们具有高度合成蛋白质的能力(相对于IgG而言);他们能够使细胞密度增至很高倍数。作为该实施例的一个显著特点，本专利技术通过将上述骨髓瘤细胞的有利特征与SV40启动区和强化因子强有力地表达出的增强效应相结合，可以成功地产生大量的肽。此外，本专利技术涉及一种重组体质粒，该质粒具有处于用于合成所需要的肽的编码基因的5′末端上行链及3′末端下行链上的SV40早期启动区顺序，并涉及用该重组体质粒转化的动物细胞。附图说明图1和图2载体构造图。 图3和图4显示DNA片段的限制图。 图5～12显示所用各个质粒的粗糙型限制图。 将引入动物细胞的质粒加入到动物染色体DNA中并保持其稳定。基因产物即肽稳定地由转化细胞产生，而转化的细胞又能够长久地存活着。 不产生骨髓瘤细胞或不分泌(就IgG而言)骨髓瘤细胞的用途是能够避免IgG的污染，因此有利于所需的肽的纯化。此外，由于骨髓瘤细胞能够在动物，例如在小鼠的腹膜腔内增殖，所以基因产物(肽)预计可以作为副产品大量产生。 本专利技术的另一个特点就是使用带有位于所需肽(如IFN)编码异源基因的5′末端上行链和3′末端下行链两者上的SV40启动区，使基因产物的产率增加到大约10倍。 用作宿主细胞的细胞可以是上述的各种骨髓瘤细胞，例如小鼠、大鼠和人体的骨髓瘤细胞，其中从产品纯化的角度来看，非IgG产生的或非IgG分泌的细胞较为适宜。P3-X63-Ag8-U1(不分泌型)HGPRT、X63-Ag8-6.5.3(不产生型)HGPRT和SP2/O-Ag14(不产生型)HGPRT等细胞系都是大鼠骨髓瘤细胞系的例子，并已为大家熟知(Munemura编《细胞培养手册》，Kodansha，东京，1982年)Iwasaki等，《单克隆抗体》，Kodanrha，东京，1982年)。 准备应用的载体最好具有能在动物细胞内产生基因表达的有效的启动区(如SV40启动区、BPV启动区、金属硫因(metallothionein)启动区、dhfr启动区、各种长度末端的还原病毒的重复或已为公众所熟知的所有LTRS)和选择的标志。选择的标志可以是如上所述的，例如，Eco-gpt、tk和dhfr所有这些都是人们熟悉的。其他熟知的选择标志也可以应用。 SV40启动区的碱基顺序已公诸于《科学》杂志(Seience，200，495～498，(1978))。一种载体(在其中将SV40启动区与合成多肽所需的基因相结合)的建造可轻易地由一位熟悉该领域的作业人员来完成。例如可参阅下面所提供的实施例。用于载体建造所需的DNA片段的切割、合成、分析、分离和其他处理都可用常规技术(Am.J.Hum.Genet，31，531(1979);T.Maniatis等“分子的克隆”，冷泉实验室(1982))。 原生质体融合方法和磷酸钙方法等都能用于通过将基因引入动物细胞的重组质粒来转化动物细胞。(Mol.Cell.Biol.，1(8)，743～753(1981);Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，825～829(1983);OgawaraWakariyasui Idenshi Kumikae(可理解的基因重组)，144～165页，Hirokawa Shoten，Tokyo(1985))。 在体外或体内都能有效地进行细胞增殖。 适宜地选择细胞增殖系统决定于高效地产生所需的肽的条件和目的(Iwasaki等Tankuron Kotai(单克隆抗体)，Kodansha，Tokyo(1982))。 用于体外培养，可以用一般用于体外培养骨髓瘤细胞的培养基如加有10%(体积/体积)牛犊胎盘血清(FCS)的RPMI-1640培养基或加有10%(体积/体积)FCS或人造血清的RDF培养基(RPMI-1640∶DMEM∶F12＝8∶1∶1)。(添加物第27号，Tanpakushitsu，Kakusan，Koso(蛋白质，核酸和酶)，453～455(1984))。 在体外培养可用培替氏培养皿和旋转瓶。使用空心丝的高密度培养法也是颇有效益的。体外培养可以用各种熟知的方法处理(Munemura编Saibo Baiyo Manual(细胞培养手册)，Kosansha，Tokyo(1982)和Fukui等编Saibo Baiyo Gijutsu(细胞培养技术)，Kodansha，Tokyo，1985)。因此，举例而言，体外细胞培养是在5%二氧化碳存在下进行的。 体内骨髓瘤细胞的增殖可以在本领域熟知的动物的腹膜腔内进行。动物，特别是上面已经提及的小鼠品种Balb/c nu/nu或Balb/c，有可能将骨髓瘤细胞移植在其腹膜腔内。 要产生的肽对本专利技术而言其要求并不严格。这些肽的实例包括淋巴激活素，如干扰素、肿瘤坏死因子和中间白细胞素(Interleukin);激素，如胰岛素和生长激素;抗原蛋白，如肝炎疫苗和流感疫苗;组织血纤维蛋白溶酶原激活本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生所需肽的方法，包括：（１）用具有ＳＶ４０早期启动区顺序的载体转化哺乳动物细胞，该ＳＶ４０早期启动区顺序位于所需的肽编码基因的５′末端上行链上和３′末端下行链上，（２）培养转化细胞，和（３）纯化所需的肽。

【技术特征摘要】
JP 1986-4-14 85527/861.一种产生所需肽的方法，包括(1)用具有SV40早期启动区顺序的载体转化哺乳动物细胞，该SV40早期启动区顺序位于所需的肽编码基因的5′末端上行链上和3′末端下行链上，(2)培养转化细胞，和(3)纯化所需的肽。2.一种产生所需的肽的方法，包括(1)用具有SV40早期启动区顺序的载体转化骨髓瘤细胞，该SV40早期启动区顺序位于所需的肽编码基因的5′末端上行链上和3′末端下行链上，(2)培养转化细的胞，和(3)纯化所需的肽。3.一种具有SV40早期启动区顺序的载体，该启动区顺序位于所需的肽编码基因的5′末端上行链上和3′末端下行链上。4.一种用具有SV40早期启动区顺序的一种载体转化的哺乳动物细胞，该启动区顺序位于所需的肽编码基因的5′末端上行链上和3′末端下行链上。5.一种如在权利要求4中所要求专利保护的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是一种骨髓瘤细胞。6.一种如在权利要求2中所要求专利保护的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：村上贤司，殿冈康昭，齐藤德江，中筋公吉，杉山则文，
申请(专利权)人：第一制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]