用于治疗和预防多毒素梭状芽胞杆菌毒素导致的疾病的氨基酸序列制造技术

讲述识别多毒素梭状芽胞杆菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）内毒素（Ａ毒素）或细胞毒素（Ｂ毒素）配体片段的抗原决定区、移位片段和催化片段并且可中和这些毒素的单克隆抗体。以及单克隆抗体的生产和在治疗、预防相应毒素导致的疾病方面的应用。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】治疗和预防多毒素梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)毒素引起的疾病的氨基酸序列本专利技术的内容是从产生抗体的细胞、特别是产生单克隆抗体的杂交瘤细胞获得可中和多毒素梭状芽胞杆菌产生的内毒素和/或细胞毒素的氨基酸序列(多肽)。此外，对人体化的针对多毒素梭状芽胞杆菌毒素的单克隆抗体以及单克隆抗体的多变区作了描述。最后，本文也讲了获得这些氨基酸序列(多肽)的途径以及单克隆抗体的具体应用。众所周知，大环内酯抗菌素如克林达霉素(Clindamycin)可引起严重的肠道疾病，表现为腹泻，严重时甚至有致死的假膜性结肠炎(PMC)出现。起先，这些疾病被称为“克林达霉素相关的腹泻”，现今，人们知道几乎所有在临床上采用的抗菌素和细胞抑制剂都可以导致PMC的临床表现。临床上，严重腹泻是PMC的突出症状，由于体液和电介质的严重损失而导致死亡。随轻重不同，可出现腹部疼痛、血性腹泻、高热和白细胞增多。目前的治疗是停用抗菌素并给予万古霉素以及平衡液体和电解质。很长时间，人们都没有弄清楚假膜性结肠炎的病因。直到1977年，证实大便中存在有毒性作用，这种毒性作用对CHO-细胞(中国地鼠卵巢肿瘤细胞)有细胞毒作用。进一步的研究证实，假膜性结肠炎的原因是多毒素梭状芽胞杆菌及其毒素。多毒素梭状芽胞杆菌是专性厌氧、革兰氏染色阳性杆菌。它可形成近末端卵圆芽胞。其生化特点是可酵解单糖如葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸，但不能酵解甘露糖、木糖和阿拉伯糖。由于缺乏神经氨酸酶、β-半乳糖甙酶或涎酸酶，多毒素梭状芽胞杆菌不能将这些单糖从胃肠粘蛋白的侧链上裂解开来。在正常人体中，由于其生化特性，梭状芽胞杆菌在肠道不能构成危害。采用抗菌素或细胞抑制剂时，肠道正常菌丛因多毒素梭状芽胞杆菌而失调，后果就是PMC。多毒素梭状芽胞杆菌产生两种致病因子内毒素(A毒素)和细胞毒素(B毒素)。这两种毒素的获得、提纯、特性以及它们在制造单克隆抗体方面的应用，在欧洲专利说明书153 519和209 273、美国专利说明书4 879 218和5 098 826以及国际专利登记WO91/18293中都有详细说明。显然，抗体在防止多毒素梭状芽胞杆菌感染的后果中起着很重要的作用。在PMC患者身上，可以查到针对A毒素和B毒素抗体。给地鼠抗菌素以后，再将其感染可产生毒素的多毒素梭状芽胞杆菌，可以在它们身上观察到典型的PMC，并且地鼠因此而死亡。如果事先用毒素对地鼠进行免疫，则它们不会患病。而毒素可以用抗体进行中和，这些抗体针对C-末端重复配体片段、中央移位片段或针对N-末端催化片段而发挥效用(片段结构请参见文献〔1〕)。第一种情况防止了毒素和细胞受体的结合，后种遏制了毒素介导的糖酵解反应，而针对中央移位片段的抗体阻止毒素向细胞内侵入。这样，中和A毒素和/或B毒素的抗体提供了一个治疗和/或预防多毒素梭状杆菌引起的疾病的可能性，其作用方式不是灭菌，而是遏制毒素的作用。相应疾病的治疗和预防是对因的。以A毒素为例，DSM ACC 2322细胞系可产生TTC8抗体，此抗体不仅和A毒素结合，而且也可中和其生物作用。TTC8抗体和A毒素结合的位置已经确定是在重复配体片段内。抗体和毒素的结合防止了后者和细胞受体的结合。单克隆抗体TTC8的结合位置是在A毒素的2480-2539氨基酸之间，其抗原序列(很可能)是TINGKYYF。美国US4879218号专利说明中的单克隆抗体PCG-4是和A毒素的2098-2141氨基酸之间的蛋白片段结合。DSM ACC 2321细胞系产生的单克隆抗体2CV同样是和B毒素的配体片段向结合。位置是在B毒素的2233-2366氨基酸之间的蛋白片段。单克隆抗体PCG-4和单克隆抗体TCC8都是小鼠抗体，它们虽不适于人体治疗，但很适合作为诊断的辅助工具。下面是我们实验室生产的单克隆抗体及其特性针对目标毒素a)毒素b)催化片段b)1212 2612，2688，3110，1502，1115移位片段b)2825，2836，5288 2703，2740，2747，2754，5288，2784，2788配体片段b)2620，TTC8 2912，2914，2916，2926，2562 2CV注释a)抗体在免疫电泳识别列举区域的重组蛋白。b)A毒素和(B)毒素的片段氨基酸位置催化片段1-879(1-877)；移位片段880-1848(878-1850)；配体片段1849-2681(1851-2360)。所有上述讲到的毒素特异单克隆抗体是从小鼠获得的，除小鼠以外，在别的种属(人或动物)这些抗体不能用于治疗和预防疾病。小鼠外的种属会识别这些抗体，因而产生免疫反应，造成抗体失活。因为目前不能确定这些抗体的变区和多变区，所以不能做到通过改良而使其适用于其他种属，特别是人体。本专利技术的目的是获得适用于人体和其他动物的多肽，这些多肽有中和毒素的特性，但没有过强的免疫成分。多肽中和毒素作用的基础是抗体变区和相应毒素的结合。结合主要是由多变区决定(CDRcomplementarity determing region)。所以，关键在于鉴别和改良和毒素结合并中和毒素作用的区域(变区和多变区(CDR))，改良的目的在于避免免疫反应。这些多肽既可用于治疗也可用于预防多毒素梭状芽胞杆菌引起的疾病，既适于人体也适于动物。就目前的科研结果来看，多毒素梭状杆菌的A毒素可导致典型的假膜性结肠炎(PMC)，而针对A毒素的单克隆抗体TTC8在活体(小鼠)可以中和其毒性作用。单克隆抗体TTC8属于IgG2b，其和A毒素特异性识别是由重链和轻链的多变区介导的。也就是说，抗体的(或者多肽的)特定片段负责识别抗原。鉴别多变区可使我们将多肽结构整合到其他种属的抗体序列上，从而使这些抗体适合于治疗和预防多毒素梭状芽胞杆菌引起的疾病，并且消除了从小鼠身上获得的抗体会引起的副作用。因此，问题在于查明核甙酸及其相应的氨基酸序列。以部分多肽的形式或适于人体的抗体形式(整合到人类抗体基因内)用来治疗及预防人体疾病。如前面提到的对产生TTC8抗体的DSM2322细胞系的有关序列确定。TTC8抗体通过遏制A毒素的配体片段而中和其生物活性。在DSM ACC 2322细胞系，多变区和变区多肽片段是SEQ ID No 1-12和/及SEQ ID No 13-16。这些片段在TTC8单克隆抗体起对毒素的中和作用。确定起中和作用抗体的变区可使生产相应的多肽成为可能。通过和多毒素梭状芽胞杆菌的内毒素和/或细胞毒素结合，这些多肽可消除毒素的生物效应。如SEQ ID No 13和/或SEQ ID No 16序列可单独或者整合到免疫球蛋白内用来治疗及预防多毒素梭状芽胞杆菌引起的疾病。要用于人体，则整合到人体球蛋白；用于动物，则整合到动物球蛋白。这些多肽的衍生物可通过氨基酸的切断、插入、增加或交换，也就是说通过对位基因变换而获得，这些衍生物可和本来的多肽一样通过和多毒素梭状芽胞杆菌的内毒素和/或细胞毒素相结合而消除其生物活性，因而同样可用来治疗及预防多毒素梭状芽胞杆菌引起的疾病。从德国微生物及细胞株收集有限公司(DSMZ)的DSM ACC 2322细胞系分离的TTC8抗体多变区(CDRs＝complenentarity det本文档来自技高网...

【技术保护点】
完全或部分从可和多毒素梭状芽胞杆菌的Ａ毒素和／或Ｂ毒素或者和多毒素梭状芽胞杆菌Ａ毒素和／或Ｂ毒素的重组残片相结合的抗体多变区序列获得的氨基酸序列（多肽）。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯托夫冯艾克尔施特赖伯，麦克尔默斯，
申请(专利权)人：克里斯托夫冯艾克尔施特赖伯，
类型：发明
国别省市：DE[德国]