两步微生物发酵生产1，3丙二醇的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，特别涉及到一种两步微生物发酵法生产１，３－丙二醇的技术。本发明专利技术的特征在于首先使用一种好氧微生物菌种发酵如葡萄糖、淀粉糖化液、纤维素酶解液等碳水化合物产生甘油，进而再通过另一种厌氧微生物菌种将甘油转化为１，３－丙二醇，其中第一步发酵所得到的发酵液可离心或过滤除去菌体，清液可直接进入第二步发酵或者经浓缩后作为第二步发酵的批式流加液，部分菌体可在连续发酵时循环使用；第一步发酵液也可不离心经灭菌后再进行第二步发酵。本发明专利技术的优点是利用廉价原料，充分发挥了每一步发酵的特点，节省了甘油分离的费用，降低了生产成本，缩短了整个发酵时间，提高了生产效率，为微生物发酵法生产１，３－丙二醇的工业化提供了经济可行的发酵工艺。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,3丙二醇的方法
本专利技术属于生物工程
，特别涉及到，3-丙二醇的方法。
技术介绍
众所周知，1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，还可用作药物合成中间体。1，3-丙二醇最主要的用途将是作为聚合物单体合成性能优异的高分子材料。1，3-丙二醇可以替代乙二醇、1，2-丙二醇，1，4-丁二醇和新戊二醇等中间体用于生产多醇聚酯及作为碳链延伸剂。用1，3-丙二醇与对苯二甲酸合成的聚酯PTT(聚对苯二甲酸丙二酯)比以乙二醇、丁二醇为单体合成的聚合物PET(聚对苯二甲酸乙二酯)、PBT(聚对苯二甲酸丁二酯)具有更优良的性能，如尼龙样的弹性恢复、抗紫外、臭氧及氮氧化物的着色性、低静电、低水吸附、全色范围内无需添加任何特殊化学品而呈现出的良好的连续印染性及可生物降解性等。PTT被认为是一种兼具PET的高性能和PBT的易加工性的新型聚酯材料，具有广阔的应用前景，但目前昂贵的价格却阻碍了其广泛应用。目前1，3-丙二醇的生产方法主要是化学合成法，如壳牌公司以乙烯为原料，在高温(280℃)下用银作催化剂氧化成环氧乙烷，然后加氢和一氧化碳转化成3-羟基丙醛，最后氢化成产品1，3-丙二醇；Degussa公司则以丙烯为原料，在350℃、0.2Mpa下以钼作催化剂氧化为丙烯醛，再水化为3-羟基丙醛，然后氢化成1，3-丙二醇(USP5008473)。这两种方法都需要在高温和贵重催化剂作用下进行，产品除1，3-丙二醇外还有1，2-丙二醇及其二聚体、三聚体等性质相近的副产物，致使产品分离提纯较困难，生产成本相应较高。微生物法转化甘油为1，3-丙二醇的研究始于1881年，但直到20世纪80年代才逐渐引起人们的重视。与化学合成法相比，它具有条件温和、操作简便、副产物少、无环境污染等特点。目前1，3-丙二醇的微生物生产法大致可分为三类一是用肠道细菌将甘油歧化为1，3-丙二醇(USP 5254467；EP 0373230 A1)；二是以葡萄糖为底物用基因工程菌生产1，3-丙二醇(PCT/US96/06705；USP5599689；USP6025184；WO96/35796；WO9821340；WO9821339；ZL96195288)；三是将生产甘油和生产1，3-丙二醇的两株菌混合培养(USP5599689)。这些方法各有优缺点，第一种方法的转化率和产物浓度均较高，但甘油价格偏高，影响1，3-丙二醇的成本；第二种方法可以降低原料成本，但基因工程菌的生产能力及其稳定性还不太理想；第三种方法有助于减少两步发酵的时间，但由于两种菌的生长条件不尽相同，如产甘油菌(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、接合酵母(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)、假丝酵母(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、德巴利酵母(Debaryomyces sp.)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、曲霉(Aspergillus)、芽孢杆菌(Bacillus)、毛霉(Mucor)等)通常在好氧条件下生长，而产1，3-丙二醇菌(如克雷伯氏菌(Klebsiella)、柠檬菌(Citrobacter)和梭状芽孢杆菌(Clostridia)等)通常在厌氧条件下生长，因此很难取得较为理想的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用廉价的淀粉、纤维素作原料，经酶解得到葡萄糖溶液后，再通过两步发酵生产1，3-丙二醇，即第一步采用好氧发酵将葡萄糖转化为甘油，第二步采用厌氧发酵将甘油转化为1，3-丙二醇，为微生物发酵法生产1，3-丙二醇提供一种切实可行的工艺，以解决发酵周期长、转化率低和生产成本高等技术难题。技术方案本专利技术提供了一种，3-丙二醇的方法，首先使用一种好氧微生物细胞把葡萄糖、淀粉糖化液、纤维素酶解液等碳水化合物转化为甘油，再通过另一种厌氧微生物细胞将上步发酵液中的甘油进一步转化为1，3-丙二醇。第一步甘油发酵所得到的发酵液用离心或过滤的方法除去或循环利用菌体，离心上清液或过滤的滤液直接进入第二步发酵或者经蒸发浓缩后作为第二步发酵的批式流加液；第一步发酵液也可不离心经灭菌后再进行第二步发酵，而不需要添加酵母粉、酵母浸膏或维生素B12。实现本专利技术方法的步骤如下1)糖化液的制备按淀粉与水1∶2.5的比例配制淀粉液，加入适量耐高温液化酶(α-淀粉酶)(4～6u/g淀粉)，于90～100℃搅拌液化60min，然后冷却至60℃，调pH4.0～4.5；按200u/g淀粉的量加入糖化酶(B-淀粉酶)，于60℃恒温下糖化24小时后，过滤，得糖化液。2)培养基的制备培养基中必须具备微生物生长所需的营养成分，如葡萄糖或甘油等碳源，尿素、铵盐、酵母浸膏或酵母粉等氮源以及磷酸盐(磷源)和硫酸盐(硫源)等。另外还需要钠、钾、镁、钙等阳离子以及锌、铁、锰、铜、钴、硼和钼等微量元素，每种微量元素的含量大约在0.01mg/L～50mg/L的范围内。培养基须在121℃下灭菌15～20分钟方能使用。3)种子培养在摇瓶中进行，摇床转速为100～300转/分钟，温度为27～40℃，培养时间为9～30小时。4)发酵培养可在发酵罐中进行，发酵罐接种量为5％～20％，搅拌桨转速为100～400转/分钟，温度为27～40℃。发酵过程中可以向发酵罐中通氮气或空气，通气量为0.2～4vvm。发酵方式可以是间歇发酵、批式流加发酵或连续发酵，间歇或批式流加发酵的时间为10～200小时，连续发酵时先进行间歇发酵，待发酵液中菌体达到一定密度时(如650nm下光密度为2～5)，再流加发酵培养基(含葡萄糖或甘油浓度为40％～99％)进行恒化培养。第一步甘油发酵葡萄糖浓度可在10％～50％范围内，pH控制在3.5～5.5范围内，葡萄糖的消耗率可达到80％～95％，产物甘油的浓度可达到5％～30％；第二步1，3-丙二醇发酵甘油初始浓度为2％～15％，pH为6～8，产物1，3-丙二醇的浓度可达到10～85g/L。本专利技术方法的优点和有益效果在于充分发挥了每一步发酵的特点，使好氧菌和厌氧菌都能在各自最优的条件下生长，从而提高甘油和1，3-丙二醇的产率，并且节省了甘油分离的费用，降低了生产成本，缩短了整个发酵时间，提高了生产效率，为微生物发酵法生产1，3-丙二醇的工业化奠定了基础。该技术既适合于以葡萄糖为原料的生产，又适合于以淀粉或纤维素为原料的生产；可以在一个生物反应器中进行操作，也可以用两个反应器串联操作；另外还可应用于甘油和1，3-丙二醇的联产。具体实施例方式以下详细叙述本专利技术的最佳实施例1)菌种本专利技术实施例中第一步发酵所用菌种为克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)，是一种好氧的耐高渗酵母；第二步发酵的菌种为克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)，是一种厌氧菌。它们都购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，菌种保藏号分别是AS2.1708和AS1.1736。2)培养基分种子培养基和发酵培养基两种，分述如下2.1克鲁斯假丝酵母A.种子培养基葡萄糖10％，玉米浆3‰，尿素3‰，pH4.0～4.5B.发酵培养基葡萄糖25％，玉米浆2.5‰，尿素2.5‰，pH4.0～4.52.2克雷伯氏杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用葡萄糖和淀粉、纤维素等酶解液经两步微生物发酵生产１，３－丙二醇的方法，在温度、ｐＨ和搅拌转速恒定的条件下，进行间歇、批式流加或连续发酵，首先用酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、接合酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ）、假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ）、汉逊酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、德巴利酵母（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、克鲁维酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、毛霉（Ｍｕｃｏｒ）等好氧菌将葡萄糖转化为甘油，继而用克雷伯氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、柠檬菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）和梭状芽孢杆菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）等厌氧菌将甘油进一步转化为１，３－丙二醇，发酵过程中菌种的接种量为５％～２０％，发酵罐搅拌桨转速为１００～４００转／分钟，温度为２７～４０℃，氮气或空气的通气量为０．２～４ｖｖｍ，第一步甘油发酵中ｐＨ控制在３．５～５．５之间，葡萄糖的消耗率达到８０％～９５％，产物甘油的浓度达到５％～３０％；第二步１，３－丙二醇发酵中甘油初始浓度为２％～１５％，ｐＨ为６．０～８．０，产物１，３－丙二醇的浓度达到１０～８５ｇ／Ｌ；该专利技术方法的特征在于： ａ）第一步甘油发酵所得到的发酵液不必去除菌体，直接加热灭菌后补加第二步１，３－丙二醇发酵所需要的微量元素，接种进行第二步发酵，而不需要添加酵母粉、酵母浸膏或维生素Ｂ１２； ｂ）第一步甘油发酵液用离心或过滤的方法除去菌体，向清液中加入第二步发酵所需要的营养成分和菌种继续进行第二步发酵； ｃ）批式流加发酵时，第一步甘油发酵所用的流加液是浓葡萄糖溶液或者浓缩的淀粉糖化液、纤维素酶解液，其中葡萄糖的浓度为４０％～９０％，第二步１，３－丙二醇发酵的流加液是经蒸发浓缩的甘油发酵液，其中甘油的浓度为４０％～９０％； ｄ）连续发酵时，第一步甘油发酵和第二步１，３－丙二醇发酵的发酵液用离心或过滤方法分离后的菌体浓缩液以１０％～９０％的比例循环利用； ｅ）两步发酵所用的原料是葡萄糖、淀粉糖化液、纤维素酶解液等碳水化合物，其中葡萄糖含量在１０％～５０％之间。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：修志龙，刘海军，张代佳，徐友海，贾凌云，
申请(专利权)人：大连理工大学，中国石油天然气股份有限公司吉林石化分公司研究院，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]