松茸混菌发酵培养方法及其培养基技术

本发明专利技术公开了一种用于松茸混菌发酵的培养基，它含有０．０１－５０ｍｇ／ｋｇ钴元素；还公开了一种混菌发酵法，该方法包括步骤：（ａ）分别制备松茸和共酵菌株的发酵种子液；（ｂ）将步骤（ａ）中制得的松茸和共酵菌株的发酵种子液接种于发酵罐，在０．０１－５０ｍｇ／ｋｇ钴元素的适合混菌生长的条件下，混菌深层培养松茸和共酵菌株。本发明专利技术还通过了从混菌发酵获得的多糖等活性基料，以及含有活性基料的组合物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及混菌发酵领域，尤其是以松茸为共酵菌改变产品生物活性和感官性状的方法。
技术介绍
松茸，称作‘菇中之王’的珍稀大型野生食用真菌，口感独特，香气浓郁。虽然，曾有研究报道其多糖类物质对小白鼠肉瘤S-180的抑瘤率可达91.8％，对艾氏腹水癌抑瘤率为70％，具有极有效的抗癌作用，在27种具有抗癌作用的担子菌中位居第二，是重要的抗癌药物筛选对象，能提高非特异性免疫和特异性免疫功能及抗应激作用(傅伟杰，许广波，许周源等，山东农业大学学报，1999，30(增)230-233)。但目前对其研究主要集中在实现人工栽培技术上，有关其生物活性功能物质(多糖、糖蛋白等)结构及功能的研究报道甚少。由于在世界范围内松茸是数量最少、最稀有、分布最狭窄的树木活体共外生菌根菌，半个多世纪研究子实体的人工栽培至今尚未实现，随着国际市场需求量不断增加，由于过量采收致使世界天然松茸产量逐年下降，频临灭绝，导致价格昂贵，日本市场零售价格高达1275美元/Kg。研究发现用两种或两种以上的真菌混菌发酵，产生的混合真菌多糖的种类、结构、生物活性，例如抗癌抑癌作用，提高免疫功能等，与单一真菌有所差别，也不等同两种真菌单独发酵产物的简单叠加。原因是由于活性物质间的协同，增效，互补，及产生了新的生物活性物质，其生理功能效果优于原来的单独产物。目前，对真菌的混菌发酵研究尚少，没有以松茸为共酵菌，利用混菌发酵技术改变真菌活性成分的报道。因此，通过微生物工程技术获得松茸产品的工业化生产力在必行。对使用松茸作为共酵菌，获得提高和改变生物活性和感官性状的产品有迫切需要。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的是提供一种混菌发酵的方法，其中通过与松茸混菌发酵改变了两种单菌的单独产物，改进了其生物活性和产品的感官性状。本专利技术的另一个目的是提供一种专用于上述松茸混菌发酵方法的培养基。本专利技术的另一个目的是提供由上述发酵方法获得的发酵产物，其中含有高分枝度的多糖和具有多元醇基团和β-(1→3)主链相连的结构的多糖。本专利技术的另一个目的是提供上述发酵产物制备生物活性基料和药品、保健品、食品中的用途。在本专利技术的一个方面，提供了一种用于松茸发酵的培养基，该培养基含有0.01-50mg/kg，优选0.1-5mg/kg钴元素。在一个优选例中，本专利技术的培养基中还含有浓度为0.005-0.5wt％的延胡索酸。在本专利技术的另一个方面，提供了一种松茸发酵法，该方法包括步骤(a)制备松茸发酵种子液；和(b)将步骤(a)中制得的松茸发酵种子液接种于发酵罐，在0.01-50mg/kg钴元素的条件下，培养松茸。在本专利技术的另一个方面，提供了一种混菌发酵法，该方法包括步骤(a)分别制备松茸和共酵菌株的发酵种子液；和(b)将步骤(a)中制得的松茸和共酵菌株的发酵种子液接种于发酵罐，在0.01-50mg/kg钴元素的混菌生长的条件下，混菌深层培养松茸和共酵菌株。在一个优选例中，该培养基中含有0.1-5mg/kg钴元素，且所述适合混菌生长条件还包括浓度为0.005-0.5wt％的延胡索酸。在另一个优选例中，另一种共酵菌株选自云芝、灵芝或其组合。在还有一个优选例中，发酵温度是25-37℃，pH是4.5-5.5，培养时间是12小时-10天。在另一个优选例中，该方法还包括步骤(c)提取菌丝中的胞内多糖和发酵液中的胞外多糖。本专利技术的另一个方面提供了一种多糖，该多糖是松茸混菌发酵的胞内多糖和/或胞外多糖，且具有含量占发酵得到的胞外多糖和胞内多糖总量20％以上的高分枝度和多元醇基团及β-(1→3)主链相连的结构的多糖；该多糖是通过以下步骤制备的 (a)分别制备松茸和共酵菌株的发酵种子液；(b)将步骤(a)中制得的松茸和共酵菌株的发酵种子液接种于发酵罐，在0.01-50ug/kg钴元素的适合混菌生长的条件下，混菌深层培养松茸和共酵菌株；(c)提取菌丝中的胞内多糖和发酵液中的胞外多糖。本专利技术的另一个方面还提供了一种组合物，其特征在于，该组合物含有载体和选自下组的活性基料松茸混菌发酵的混菌菌丝体、混菌发酵液、纯混合真菌多糖、纯混合真菌糖蛋白，或其混合物。附图简述附图说明图1是流程图，显示了实施例1所述的灵芝/云芝、松茸菌种单独发酵和混菌共酵，以及其各产物制备产品进行实验的流程图。具体实施例方式发酵培养基工艺、配方是松茸混菌发酵生产技术的关键所在。根据本专利技术人的多年野外考察，从各地生长松茸的环境进行采样研究，发现在生长松茸的环境中生长前后钴离子的含量都大大降低。在经过实验室培养条件探索后，发现钴离子是松茸菌丝体生长的必需因子。通过添加一定浓度的钴离子，可使松茸在单独发酵或混合发酵中快速繁殖生长，累积多糖。本专利技术的松茸培养基(如深层发酵培养基)除了含有碳源，氮源和微量元素等常规成分外，还含有钴元素，其含量是约0.01-50mg/kg，优选是约0.1-5mg/kg。在该浓度下松茸种子(松茸菌丝体)和共酵真菌能快速繁殖生长。钴离子可以各种形式加入，较佳地以钴盐形式加入培养基中，例如六水合硝酸钴等。在培养基中还可以含有延胡索酸。延胡索酸在松茸的生长中可起生长促进作用，其浓度范围通常为约0.005-0.5wt％，较佳地为0.01-0.1wt％，按培养基总重量计。至于本专利技术的培养基中含有的其它常规成分，例如碳源，氮源和微量元素，没有特别限制。可以采用常规的培养基中相应成分及用量，例如3％麦芽糖，0.2％KH2PO4，0.1％Mg2SO4·7H2O及微量元素。这些成分可用本领域技术人员熟知的其它成分替代。本领域的技术人员不难确定其含量。本专利技术的混菌发酵方法对于使用的松茸菌株没有特别限制，可用任何市售的松茸菌株(可从例如上海农科院等处购得)，或者用常规方法分离得到的松茸的菌株。与其混合发酵的真菌也没有特别限制，可用例如云芝、灵芝等，或其他具同等功能的真菌组合。灵芝、云芝的菌株可以是任何市售的菌株(可从例如中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)等处购得)，或者用常规方法分离得到的菌株。在本专利技术的混菌发酵方法中，除了必需加入钴元素外，与常规的发酵方法没有区别。发酵可以是间歇式或连续式发酵。在间歇式混菌发酵生产过程中，可以采用常见的二步法，即先培养各菌种获得种子液，然后将种子液接种至大的发酵罐，进行大规模发酵。发酵温度可以是约25-37℃，pH是4.5-5.5，培养时间是12小时-10天。优选发酵温度为约30℃，pH5.0，培养时间为48小时-5天。在大规模发酵后，按常规方法获得菌丝体和发酵液，并进行加工处理。例如，先过滤浓缩发酵液，用95％乙醇醇析获得沉淀物，用75％乙醇洗涤数次，冻干，获得胞外多糖。通过粉碎菌丝体，水煮抽提，然后浓缩，同样用醇沉淀和透析、，可获得胞内多糖。发酵产物中除了松茸和共酵菌本身的多糖外，还产生了高分枝度的多糖和具有多元醇基团和β-(1→3)主链相连的结构的多糖，其含量占发酵得到的胞外多糖和胞内多糖总量的约20％以上。说明该混菌发酵方法不同程度改变了多糖的组成和结构。通过实验证明多糖的药理活性和单糖间的糖苷键结合方式有关，与多糖的分枝度有关。用该混菌发酵法制备的产物，包括混菌菌丝体、混菌发酵液、纯混合真菌多糖和纯混合真菌糖蛋白。它们都可作为生物活性基料用于制备药物、食品、保健品等产品。产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于松茸发酵的培养基，其特征在于，该培养基含有０．０１－５０ｍｇ／ｋｇ钴元素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑珍，白晨，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]