吡虫啉羟基化的微生物转化方法技术

一种吡虫啉羟基化的微生物转化方法，所述的方法是：　　　　将具有吡虫啉羟基化酶活力的微生物菌种接种到培养液中，进行发酵培养；或接种到含有吡虫啉结构类似物的培养液中，进行诱导发酵培养；或者接种到含有吡虫啉的培养液中，诱导微生物产生羟基化酶活力的同时，进行吡虫啉羟基化转化发酵培养。　　　　发酵结束后，将发酵液与菌体分离，若是吡虫啉的转化发酵液，保留待与后面的转化液一并处理，所获菌体沉淀作为静息细胞，加入到含有吡虫啉的转化液中，使吡虫啉转化为羟基吡虫啉。　　　　转化结束后，去除菌体细胞，转化发酵液与转化液用有机溶剂萃取去除未转化的吡虫啉后，含有羟基吡虫啉的溶液经低温或浓缩处理，使羟基吡虫啉晶体析出。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。
技术介绍
吡虫啉(Imidacloprid，IMI)是一种高效安全、高选择性的新型杀虫剂，其作用于昆虫烟碱乙酰胆碱受体，具有触杀、胃毒和内吸活性。吡虫啉已广泛用于刺吸式口器害虫如蚜虫和叶蝉及鞘翅目害虫防治，种子和土壤处理，另外还用于建筑防治白蚁和防治猫和狗等宠物身上的跳蚤等。目前，吡虫啉已在全球一百多个国家登记，在140多种作物上使用。 目前，国内外对于吡虫啉的研究主要集中在三个方面，一是吡虫啉的作有机制和特点，包括药效、抗性和受体研究；二是吡虫啉的合成方法研究；三是吡虫啉的环境行为研究，包括土壤的吸附性、移动性、挥发性和环境降解性(光解、水解和土壤降解)研究，在作物中吡虫啉的代谢及活性研究。国内外对于吡虫啉的研究均是在动植物和土壤方面的，未见有微生物转化吡虫啉的研究。Robin sur报道，IMI被植物吸收后，转变为羟基吡虫啉(hydroxy IMI)，hydroxy IMI进一步转变成olefin IMI。Ralf Nauen等研究发现，olefin IMI对桃蚜与棉蚜的杀虫效果是IMI的16倍。他们推论经种子处理或土壤施药后，吡虫啉产生的一些具有生物活性的化合物与残留的吡虫啉一起作用，从而更有效地防治了刺吸式口器害虫。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种筛选获得可催化IMI为hydroxy IMI的微生物菌株，以便采用微生物转化的方法，获得hydroxyIMI产品。hydorxy IMI可作为先导化合物，经脱水后得到olefin IMI，或者将hydroxy IMI的羟基经过卤素置换后获得卤代吡虫啉。本专利技术采用分离保藏的具有吡虫啉羟基化酶活力的微生物菌种，接种到培养液中进行发酵培养；或接种到含有浓度大于0.001％(质量比，以下同)吡虫啉结构类似物的培养液中，进行诱导发酵培养；或者直接加入吡虫啉到培养液中，诱导微生物产生羟基化酶活力的同时，进行吡虫啉羟基化转化发酵培养。发酵结束后，将发酵液与菌体分离。若是吡虫啉的转化发酵液，保留待与后面的转化液一并处理。所获菌体沉淀作为静息细胞，加入到含有吡虫啉的转化液中，使吡虫啉转化为羟基吡虫啉。转化结束后，去除菌体细胞，转化发酵液与转化液用有机溶剂萃取去除未转化的吡虫啉后，含有羟基吡虫啉的溶液可经低温或浓缩处理，使羟基吡虫啉晶体析出。上述具有吡虫啉羟基化酶活力的微生物菌种，可以是Alcaligenes spp.，Stenotrophomonas spp.，Serratia spp.，Pseudomonas spp.，proteus Spp.，Erwiniaspp.，Bacillus spp.，Escherichia spp.，Staphylococcus spp.，Xanthomonas spp.，Saccharomyces spp.，Rhodotorula spp.，Aspergillus spp.Rhizopus spp.，Saprolegniaspp.，Beauveria.spp，streptomyces.spp等，也可以是任何可羟基化吡虫啉的微生物或混合微生物。属于Alcaligenes属的微生物有Alcaligenes eutrophus 1.1841；属于Stenotrophomonas属的微生物有Stenotrophomonas maltophilia；属于Serratia属的微生物有Serratia marcescens；属于Pseudomonas属的微生物有Pseudomonasputida；属于proteus属的微生物有proteus vulgaris；属于Erwinia属的微生物有Erwinia stewartii；属于Bacillus属的微生物有Bacillus thuringiensis，Bacillusmucilaginosus，属于Escherichia属的微生物有Escherichia coli，属于Staphylococcus属的微生物有Staphylococcus aureus；属于Saccharomyces的微生物有Saccharomyces cerevisia。属于Rhodotorula属的微生物有Rhodotorulaminuta；属于Aspergillus属的微生物有Aspergillus niger；属于Rhizopus属的微生物有Rhizopus stolonifer；属于Saprolegnia属的微生物有Saprolegnia ferax；属于Streptomyces属有streptomyces jingyangensis。这些微生物的转化率见下表 上述用于发酵培养的培养液的营养物质没有特别的限制，可以是任何一种适合于微生物生长的营养介质。上述诱导剂可以是烟酸、3-甲基吡啶、3-氰基吡啶等任何含有吡啶环结构的化合物，也可以是2-硝基亚胺基咪唑烷等任何含有咪唑烷或咪唑结构的化合物，也可以是吡虫啉或吡虫啉的其他结构类似物。诱导剂的浓度大于0.001％。诱导剂可预先溶解在培养基中。上述吡虫啉羟基化微生物发酵培养条件是10-60℃，1-300rpm摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，发酵5-96小时。上述的发酵液与菌体分离，可采用＞1000rpm的离心分离方法、或过滤分离方法获得菌体沉淀。上述若是吡虫啉的转化发酵液，与菌体分离后，不含菌的转化发酵液为IMI和hydroxy IMI的混合物。转化发酵液可保留与后面的转化液一并处理。上述的吡虫啉羟基化静息细胞转化反应可在水相、有机相或水-有机相双相中进行，水相转化条件为，底物浓度大于0.01g/L，在任意一种PH7-8的中性、偏碱性，含有浓度大于0.01％碳源的缓冲溶液中。有机相为二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜，或其他对细胞毒性较小的有机溶剂。水-有机相为上述水相和有机相的混合物。转化温度范围在10-60℃，1-300rpm摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，反应时间5-192小时，转化结束后，将转化液与菌体通过离心或过滤分开，可获得含有hydroxy IMI的转化液。上述转化液中需要加入浓度大于0.01％的碳源物质，以维持菌体基础代谢活力。碳源可以是蔗糖、葡萄糖、果糖、可溶性淀粉或任何其他糖质，也可以是苹果酸、柠檬酸，或任何其他有机酸，也可以是乙酸钠、酒石酸钠等有机酸盐。上述含有hydroxy IMI溶液可加入二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮等有机溶剂，振荡、萃取去除未转化的吡虫啉，静置或离心分层后，含有hydroxy IMI的溶液可经低温或浓缩结晶后，可使hydroxy IMI晶体析出。具体实施例方式实施例1、将100ml含0.1％吡虫啉的LB培养基放入500ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Stenotrophomonas maltophilia菌种，30℃，200rpm振荡发酵培养，20小时后，停止发酵，离心使菌体和发酵液分离，取62.5ml菌液的菌体加入到含有0.1％吡虫啉，4％蔗糖的25ml磷酸盐缓冲液(PH7.0)的250ml三角瓶中，30℃，200rpm振荡通气进行吡虫啉羟基化静息细胞转化反应，96小时后，停止转化反应，离心去除菌体，上清液用5ml二氯甲烷萃取两次本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴亦军，袁生，葛峰，戚铭盛，徐尚成，马海军，倪珏萍，张湘宁，
申请(专利权)人：南京师范大学，江苏省农药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：