腈水合酶和生产酰胺的方法技术

本发明专利技术的目的是提供能够产生２－羟基－４－甲硫基丁酰胺的腈水合酶。本发明专利技术提供新颖的腈水合酶，它使用α－羟基腈作为底物产生α－羟基酰胺，还提供其编码ＤＮＡ。该酶可以从红球菌获得。进而，该酶的酶活性在反应期间得以稳定地保持。本发明专利技术提供生产酰胺化合物的方法，该方法使这种酶与腈化合物反应的步骤。按照本发明专利技术，从羟基腈化合物可以通过生物化学作用生产对应的酰胺化合物，而不会减少腈水合酶的酶活性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新颖的腈水合酶(nitrile hydratase)和使用该腈水合酶从腈化合物生产酰胺化合物的方法。
技术介绍
为了提高腈水合酶的表达水平，已经检验了利用遗传工程在微生物细胞中过量表达腈水合酶的方法和使用这些细胞转化腈化合物为对应的酰胺化合物的方法。例如，已知的腈水合酶是源于下列微生物的。所有腈水合酶都是由两种类型的异种亚单位组成的酶。红球菌(Rhodococcus)属(已审日本专利申请公报(JP-B)NO.平3-54558)红球菌属(未审日本专利申请公报(JP-A)NO.平2-119778)假单胞菌(Pseudomonas)属(JP-A平3-251184)紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)属(欧洲专利申请NO.455646)不过，在所有情况下，利用大肠杆菌所得腈水合酶活性的表达水平都不是足够高的，该大肠杆菌是用含有任意如这些专利申请所述腈水合酶基因的插入片段的表达质粒所转化的；每重量份转化体细胞的腈水合活性低于作为基因来源的原始微生物(Ikehata，O.，Nishiyama，M.，Horinouchi，S.and Beppu，T.″Primary structure of nitrile hydratase deducedfrom the nucleotide sequence of a Rhodococcus speices N-774 and itsexpression in Escherichia coli″Eur.J.Biochem.181(1989)，563-570；Nishiyama，M.，Horinouchi，S.，Kobayashi，M.，Nagasawa，T.，Yamada，H.and Beppu，″Cloning and Characterization of Genes Responsible forMetabolism of Nitrile Compounds from Pseudomonas chlororaphis B23″Journal of bacteriology 173(1991)2465-2472；Kobayashi，M.，Nishiyama，M.，Nagasawa，T.，Horinouchi，S.，Beppu，T.and Yamada，H.″Cloningnucleotide sequence and expression in Escherichia coli of twocobalt-containing nitrile hydratase genes from Rhodococcus rhodochrousJl″Biochimica et Biophysica Acta.1129(1991)23-33)。如上所述，已经有可能利用基因重组技术在大肠杆菌中表达腈水合酶活性本身。不过，迄今尚不存在可利用的转化体，它具有如此高的腈水合活性，以便用于酰胺的工业生产。另一方面，在干燥无色杆菌(IFO 12668)中已经见到腈水合酶，它表现非常高的腈水合活性，还已经克隆了编码该酶的基因。进而，使用表达质粒向大肠杆菌引入该基因，利用所得转化体过度产生了腈水合酶(JP-A平8-266277)。这份报道仅显示了丙烯酰胺和α-羟基异丁酰胺的生产实例，因而在该报道中没有关于这种酶对2-羟基-4-甲硫基丁腈的活性的说明。因而，关于能够使用2-羟基-4-甲硫基丁腈(methylthiobutyronitrile)(以下缩写为HMBN)作为底物的腈水合酶知之甚少。此外，尚无使用大肠杆菌从2-羟基-4-甲硫基丁腈生产2-羟基-4-甲硫基丁酰胺(methylthiobutylamides)(以下缩写为HMBAm)的现有方法，该大肠杆菌是用含有腈水合酶基因作为插入片段的表达质粒所转化的。另一方面，关于由微生物生产α-羟基酰胺，存在一种已知的方法，使用属于芽孢杆菌属、炭疽芽孢杆菌属(the genus Bacteridium)、微球菌(Micrococcus)属或短杆菌(Brevibacterium)属的微生物从乳腈、羟乙腈、α-羟基甲硫基丁腈等生产对应的酰胺(参见JP-B昭62-21519)。另外，还存在一种从氰醇(cyanohydrin)生产扁桃酰胺(mandelamide)的公知方法(参见JP-A平4-222591；JP-A平8-89267)。不过，具有腈水合酶活性、能够转化腈化合物为酰胺化合物的酶具有这样一个问题，由于原料腈化合物或产物酰胺化合物的存在，这些酶容易丧失它们固有的酶活性。如果为了增加酰胺化作用的速率而升高腈化合物的浓度，那么腈水合酶容易在短时间内失活，从而难以在所需时间内得到反应产物酰胺化合物。另外，产物酰胺化合物也容易使腈水合酶失活，从而难以得到高浓度的酰胺化合物。此外，在不同程度上取决于化合物的类型，已知α-羟基腈在极性溶剂中部分分解为对应的醛和氢氰酸(V.Okano et al.，J.Am.Chem.Soc.，Vol.98，4201(1976))。一般而言，醛与蛋白质连接，能够使酶活性失活(Chemical Modification of Proteins，G.E.Means et al.，Holden-Day，125(1971))。进而，象醛一样，氢氰酸(氰化物)也能够抑制性地作用于很多酶。因而，从原料α-羟基腈所产生的醛和氰化物能够成为降低酶活性的原因。由于在酶水合作用或α-羟基腈水解作用中，酶在短时间内失活这一问题，难以以高生产率得到高浓度的α-羟基酰胺。为了防止酶活性的丧失，已经试验了各种增加酶活性或抑制酶活性丧失(失活)的方法。这样的努力例如包括如下在凝固点至15℃的更低温度下进行反应(JP-B昭56-38118)；从多个供给口连续供给更低浓度的底物(JP-B昭57-1234)；将微生物或其加工产物用有机溶剂处理(JP-A平5-308980)；在不饱和高级脂肪酸的存在下进行反应(JP-A平7-265090)；使微生物细胞受到戊二醛的交联处理等(JP-A平7-265091；JP-A平8-154691)；利用化学方法降低污染腈化合物的氢氰酸的浓度，然后使腈水合酶与腈化合物反应(JP-A平11-123098)；利用亚硫酸离子、酸式亚硫酸离子或连二亚硫酸离子的存在实现酶活性的长期稳定化(JP-A平8-89267)；加入醛(JP-A平4-222591)。这些方法没有一个在工业应用上具有实际的效果。尽管有些方法是有效的，不过它们仍有经济性或实用性改善的空间。例如，上述加入醛的方法需要大量的醛作为原料，是氰醇的1-5倍摩尔量，因而该方法并非经济的解决方案。类似地，加入亚硫酸离子、酸式亚硫酸离子或连二亚硫酸离子的方法要求加入离子的量等于或大于原料，因而该方法不实用。本专利技术的一个目的是提供具有很高腈水合活性的腈水合酶。本专利技术的另一个目的是提供稳定的腈水合酶，它能够在长时间内保持很高的酶活性。另外，本专利技术的另一个重要目的是提供也能够使用2-羟基-4-甲硫基丁腈作为底物的腈水合酶。此外，本专利技术的另一个目的是提供编码具有很高腈水合活性的腈水合酶的基因、含有该基因的重组质粒和含有该重组质粒的转化体。另外，本专利技术的另外一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有下列物理化学性质的腈水合酶：（ａ）作用于腈化合物的腈基，水合腈基并将其转化为酰胺基；和（ｂ）是氰化物耐受性的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：长泽透，松山彰收，
申请(专利权)人：大赛璐化学工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]