基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，包括以下步骤：步骤一、制备n份不同浓度的凝血酶标准溶液；步骤二、制备n份待检测标准溶液，具体为：将双链DNA溶液分为n份，并分别一一对应添加相同体积的不同浓度的凝血酶标准溶液，得多份凝血酶双链DNA溶液，向每份凝血酶双链DNA溶液中依次加入荧光素标记DNA溶液、内切酶Nb.BbvCI、及CutSmar缓冲液，继续添加氧化石墨烯分散液，得多份待检测标准溶液；步骤三、绘制线性方程。本发明专利技术具有方法操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行混合样品溶液中对凝血酶的高灵敏识别，对凝血酶的检出限达0.39×10

Detection of Thrombin Based on enzyme and graphene oxide aptamer sensor

The invention discloses a method for enzyme and graphene oxide aptameric sensor based on the detection of thrombin, which comprises the following steps: first, the preparation of n samples with different concentrations of thrombin in standard solution; step two, preparation of N detecting standard solution, specifically: the double stranded DNA was divided into N parts, and correspond to standard solutions of different concentrations of thrombin added the same volume, more copies of double stranded DNA thrombin solution to each thrombin double chain DNA solution followed by adding FITC labeled DNA solution, and the enzyme Nb.BbvCI, CutSmar buffer, continue to add graphene oxide dispersion, much to a standard solution; step three drawing, linear equation. The invention has the advantages of simple operation, fast detection and high sensitivity, and can identify the thrombin in the mixed sample solution with high sensitivity. The detection limit for thrombin is 0.39 * 10.

【技术实现步骤摘要】
基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法
本专利技术涉及凝血酶检测
更具体地说，本专利技术涉及一种基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法。
技术介绍
抗体虽然用于生物识别元件从发现到发展已有70多年，但是一系列缺陷(储存时间短、易降解、对pH、温度、酸碱度敏感等)不可避免地摆在人们面前。在生物检测中理想的传感器模型应该是响应快、耗时短、灵敏度高、易于小型化的，发展能够克服抗体的缺陷的类抗体物逐渐成为研究的热门。核酸适配体因亲和力强、特异性高、获得途径简单、稳定性好等诸多优点，成为了最具潜力替代抗体的生物分子识别物质，使其在近年得到了快速发展。目前，研究如何利用适配体作为传感器建立高效、高灵敏、高特异性的的检测目标分子的新方法成为新趋势。本文选用凝血酶作为研究模型，建立利用适配体传感器检测的新方法。凝血酶是一种重要的多功能蛋白酶，催化纤维蛋白原转化撑纤维蛋白，参与凝血联级过程的各个环节，促进凝血，在生物、化学、药理等领域有着广泛的应用，浓度变化异常会导致一些疾病的发生，如血栓、弥散性小管内凝血等，因此血液中凝血酶含量的测定对人体健康非常重要。传统的检测凝血酶方法技术复杂，时间长，近年来，利用适配体凝血酶的检测方法也非常多，但仍存在操作方法复杂、反应时间长、灵敏度不高等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种方法操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行混合样品溶液中对凝血酶的高灵敏识别，对凝血酶的检出限达0.39×10-9mol/L。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，包括以下步骤：步骤一、制备n份不同浓度的凝血酶标准溶液，其中，n≥2；步骤二、制备n份待检测标准溶液，具体为：向双链DNA溶液分为n份，并分别一一对应添加相同体积的不同浓度的凝血酶标准溶液，控制温度为35-39℃，混合25-35min后，得多份凝血酶双链DNA溶液，向每份凝血酶双链DNA溶液中依次加入荧光素标记DNA溶液、内切酶Nb.BbvCI、及CutSmar缓冲液，控制温度为35-39℃，反应110-130min，继续添加氧化石墨烯分散液，静置6-10min后得多份待检测标准溶液。优选的是，步骤二中双链DNA溶液的制备方法具体为：将凝血酶适配体DNA溶液加入缓冲溶液中并加入互补单链DNA溶液，升温至93-97℃后缓慢冷却至室温，得双链DNA溶液，其中，缓冲溶液为pH为7.4，浓度为0.075mol/L的Tris-HCl缓冲溶液，凝血酶适配体DNA溶液和互补单链DNA溶液体积比为1：1，浓度比为1:1。优选的是，步骤一中，n＝10，10份凝血酶标准溶液的浓度分别为：0mol/L，5×10-10mol/L，1×10-9mol/L，2×10-9mol/L，5×10-9mol/L，1×10-8mol/L，2×10-8mol/L，4×10-8mol/L，6×10-8mol/L，1×10-7mol/L；步骤二中，将双链DNA溶液分为10份，每份中加入的凝血酶标准溶液的体积均为20μl，10份待检测标准溶液中双链DNA的浓度均为1×10-8mol/L，荧光素标记DNA的浓度均为1.5×10-8mol/L，氧化石墨烯的浓度均为65mg/ml，内切酶Nb.BbvCI为10U。优选的是，所述的基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，还包括：步骤三、绘制线性方程，具体为：设定激发波长为496nm，激发狭缝和发射狭缝均为10nm，用RF-6000荧光分光光度计，检测每份待检测标准溶液的荧光光谱图，并得到每份待检测标准溶液在发射波长为522nm处的荧光强度，以每份待检测标准溶液的荧光强度为纵坐标，对应待检测标准溶液的凝血酶浓度为横坐标作标准曲线，得线性方程。优选的是，升温至93-97℃后缓慢冷却至室温具体为：置于水浴锅中升温至93-97℃后，关闭水浴锅开关，至水浴锅内水体温度冷却至室温。优选的是，多份标准溶液中CutSmar缓冲液与标准溶液的体积比为1:100，每毫升CutSmar缓冲液中包括：50mmol乙酸钾、20mmol三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐、10mmol乙酸镁、及100μg牛血清白蛋白。优选的是，氧化石墨烯分散液在添加前超声8-12min。优选的是，凝血酶标准溶液、凝血酶适配体DNA溶液、及互补单链DNA溶液的溶剂为蒸馏水或Tris-HCl缓冲溶液中的一种。本专利技术至少包括以下有益效果：采用本专利技术的基于酶与氧化石墨烯适的配体传感器对凝血酶的检测，方法操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行混合样品(例如血清样品)中对凝血酶的高灵敏识别，对凝血酶的检出限达0.39×10-9mol/L。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1是本专利技术的流程示意图；图2是本专利技术的多份标准溶液在激发波长为496nm时的荧光光谱图；图3是本专利技术的所述线性关系图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。<实施例1>一种基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，包括以下步骤：步骤一、制备10份不同浓度的凝血酶标准溶液，10份凝血酶标准溶液的浓度分别为：0mol/L，5×10-10mol/L，1×10-9mol/L，2×10-9mol/L，5×10-9mol/L，1×10-8mol/L，2×10-8mol/L，4×10-8mol/L，6×10-8mol/L，1×10-7mol/L；步骤二、制备10份待检测标准溶液，具体为：向凝血酶适配体DNA溶液加入缓冲溶液中并加入互补单链DNA溶液，置于水浴锅中升温至93℃后，关闭水浴锅开关，至水浴锅内水体温度冷却至室温，得双链DNA溶液，其中，缓冲溶液为pH为7.4，浓度为0.075mol/L的Tris-HCl缓冲溶液，凝血酶适配体DNA溶液和互补单链DNA溶液体积比为1：1，浓度比为1:1；将双链DNA溶液分为10份，并分别一一对应添加20μl的不同浓度的凝血酶标准溶液，控制温度为35℃，混合25min后，得多份凝血酶双链DNA溶液，向每份凝血酶双链DNA溶液中依次加入荧光素标记DNA溶液、内切酶Nb.BbvCI、及CutSmar缓冲液，控制温度为35℃，反应110min，继续添加氧化石墨烯分散液，静置6min后得10份待检测标准溶液，其中，10份待检测标准溶液中双链DNA的浓度均为1×10-8mol/L，荧光素标记DNA的浓度均为1.5×10-8mol/L，氧化石墨烯的浓度均为65mg/ml，内切酶Nb.BbvCI为10U，10份待检测标准溶液中CutSmar缓冲液与待检测标准溶液的体积比为1∶100，每毫升CutSmar缓冲液中包括：50mmol乙酸钾、20mmol三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐、10mmol乙酸镁、及100μg牛血清白蛋白，氧化石墨烯分散液加入前置于超声仪器中超声8min，凝血酶标准溶液、凝血酶适配体DNA溶液、及互补单链DNA溶液的溶剂为蒸馏水；步骤三、绘制线性方程，具体为：设定激发波长为4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备n份不同浓度的凝血酶标准溶液，其中，n≥2；步骤二、制备n份待检测标准溶液，具体为：向双链DNA溶液分为n份，并分别一一对应添加相同体积的不同浓度的凝血酶标准溶液，控制温度为35‑39℃，混合25‑35min后，得多份凝血酶双链DNA溶液，向每份凝血酶双链DNA溶液中依次加入荧光素标记DNA溶液、内切酶Nb.BbvCI、及CutSmar缓冲液，控制温度为35‑39℃，反应110‑130min，继续添加氧化石墨烯分散液，静置6‑10min后得多份待检测标准溶液。

【技术特征摘要】
1.一种基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备n份不同浓度的凝血酶标准溶液，其中，n≥2；步骤二、制备n份待检测标准溶液，具体为：向双链DNA溶液分为n份，并分别一一对应添加相同体积的不同浓度的凝血酶标准溶液，控制温度为35-39℃，混合25-35min后，得多份凝血酶双链DNA溶液，向每份凝血酶双链DNA溶液中依次加入荧光素标记DNA溶液、内切酶Nb.BbvCI、及CutSmar缓冲液，控制温度为35-39℃，反应110-130min，继续添加氧化石墨烯分散液，静置6-10min后得多份待检测标准溶液。2.如权利要求1所述的基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，步骤二中双链DNA溶液的制备方法具体为：将凝血酶适配体DNA溶液加入缓冲溶液中并加入互补单链DNA溶液，升温至93-97℃后缓慢冷却至室温，得双链DNA溶液，其中，缓冲溶液为pH为7.4，浓度为0.075mol/L的Tris-HCl缓冲溶液，凝血酶适配体DNA溶液和互补单链DNA溶液体积比为1：1，浓度比为1:1。3.如权利要求2所述的基于酶与氧化石墨烯适配体传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，步骤一中，n＝10，10份凝血酶标准溶液的浓度分别为：0mol/L，5×10-10mol/L，1×10-9mol/L，2×10-9mol/L，5×10-9mol/L，1×10-8mol/L，2×10-8mol/L，4×10-8mol/L，6×10-8mol/L，1×10-7mol/L；步骤二中，将双链DNA溶液分为10份，每份中加入的凝血酶标准溶液的体积均为20μl...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄珊，肖琦，姚建东，
申请(专利权)人：广西师范学院，
类型：发明
国别省市：广西,45