红酵母还原酶制剂及其制备方法以及用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种红酵母还原酶制剂及其制备方法，以及用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法。所述红酵母还原酶制剂由红酵母细胞中提取而得，包含羰基还原酶和甘露醇脱氢酶。通过甘露醇脱氢酶和羰基还原酶的反应耦合，可以使用廉价的甘露醇作为辅底物，在羰基还原反应过程中实现辅酶ＮＡＤＰＨ的原位再生和循环利用。在合成反应体系中只需加入催化量的辅酶，即可实现高浓度羰基底物的完全和高选择性还原。生产工艺简单，产品易于提取纯化，可用于制备各种高光学纯度的手性仲醇特别是（Ｓ）－芳香仲醇。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生tm^:领域，涉及由红酵母提取的含^S还原酶以及甘露醇脱氢酶的 还原酶制齐啲制备，及其用于羰割七^t/还原制备相应光争活性手性仲醇的方法。
技术介绍
光争舌性手性仲醇是很多医药、农药、香料以及其它精细化学品合成的重要中间体， 其合成有多种方法，包括化学激崔化手性仲醇的不娥尔合成以及生物催化的手性拆分或 不娥尔合成。化勞封崔化酮的不娥尔还原合成光学活性手性仲醇，通常需要结构錢的逾度金属配，作为催化剂，催化剂价格昂贵，制备和回收比较困难、对环境W^重的污染，其^，受到限制。生物^^成光学活性手性仲醇具有g低、产品光学纯 度高，无环境污染等独牛靴点，其研究、开发和应用备受国内夕卜广泛关注。目前生物催化法制备光学活性手性仲醇的途fei^W两种:一^ffil脂肪謝對树外消旋手性仲醇的对映体进行动力学拆分；二^lil还原酶衝W寸潜手性酮的羰基进行不 辦尔还原。后一种途径，原料的原子利用率为100%，产物无需,的分离、纯化步骤，工艺简便，易于进行:oik化生产。但该方法有一个比较大的岳央点，酮的还原需要等当量的还原型辅酶(NADH或NADPH)，由于还原型辅,介格昂贵，为斷氐合 *，必多耐辅 M行原位再生和重复使用。辅酶的高效再生是生物催tt^原中必须重点解决的技术问 题。用微生物整细胞作为催化剂，细胞内存在着完整的辅酶还原再生系统，在反应体系中 添加驢的培养基碳源，如葡萄糖，即可实现辅酶的自身再生，生产^*低。尽管如此， 用整细胞催化羰謝七合物还原，由于细胞内酶的含量低，因此需要大量的催化剂，催化 剂的质量可會,物质量的几倍甚至几十倍。比如杨忠华等用酵母细胞催化4-氯苯乙酮 的还原，底tT浓度低于20mM(大约3g/L)，需要加入20g/L的酵母细胞，而产物得率仅33%[见《精细tta:》，2007年24巻1期，63~66]。这种对封崔化效率比樹氐下，并且大 ^ffl胞的存S^合产品的提取、纯tt^—定的困难。用分离提取的还原酶作为催化剂，Mil其它的酶偶就崔化可实5M原型辅酶的有效再 生，工艺非常简便，催化效報高D4p; 7.必'cro&》丄历otec力/7o丄，2007， 76: 237-248]。 常用的辅酶再顿,括葡鎌鹏酶、6-磷,萄糖脱氢酶、甲,氢麟，但这些 酶的价格比较贵，鹏汀其大嫩11 用。我们teJtr的研究中，发现红酵母CGMCC-1735 (f贜于中国普通微生劍臓中心， 专利^繊号CGMCC 1735)可以催化羰謝七^t/还原合就学活性手性仲醇[中国专利技术专 禾U，公开号CN1869197A，公开日2006.11. 29]。进一步研究发现，在红酵母CGMCC-1735 细胞中除了羰基还原te外，还存在甘露醇脱氢酶，其中羰基还原酶以NADPH为辅酶， 催化羰基底物脱^ ;学活性手性仲醇；而甘露醇脱氢酶可以催化甘露醇脱氢M果 糖，以NADP+为辅酶，同时实现NADPH的再生，反应示意图如附图1戶标。
技术实现思路
为了能穀5济地妒光学活性手性仲醇，本专利技术的目的有三个，(一) 掛共一种红酵職原剂制剂(二) 掛共一种红酵職原剂制剂的制备方法(三) 樹共用红酵 原齐肺跻肺恪光学活性手性仲醇的方法(1) 红酵，原酶制剂，其特征在于，其中同时含有羰基还原酶以及甘露醇脱氢酶。(2) 红酵職原酶制剂的制备；按照已申请的专利技术专利[中国专利技术专利，公开号CN1869197A，公开日2006.11.29] 中的方法对红酵母CGMCC-1735进行发酵培养，离心收获细胞。将红酵母细胞悬浮于 Tris-HC1缓冲液中，用高压均质mi^谰胞破碎，破碎液高速离心，取离心上清液，其 中含有羰基还原S^甘露醇脱氢酶两种组分，在离心上清液中加入硫勝安进行蛋白质沉 淀，蝶35^9W疏醱安浓度区间的蛋白働冗淀，对含有f炭基还原擬口甘露醇B腹酶的蛋 白i^沉^it行冷冻^B喿，获得红,还原酉辩且酶帝跻IJ;或 —步对含有羰基还原,口 甘露醇脱氢酶的硫^t安沉淀蛋白质进行部分纯化，分离除去杂蛋白，合并含有羰基还原 ,咁露醇脱氢酶的洗脱液，进行冷冻千燥，获得部分纯化红酵母还原酶制剂。S31± 述两种方 織得的红酵母还原酶制齐购可用于催化酮的不)^尔还原，只是酶制剂中羰基还原辭口甘露醇臓酶賴不同，催化效率有一定差异。 (3)用红酵，原酶制剂制备光争活性手性仲醇的方法取一定量的羰Sf七，、甘露醇、红酵舰原酶制剂以及辅酶加A^冲液中，这SM说的羰Stt^tf选自^if或甲基被取代的苯乙酮衍生物或乙酰吡啶衍生物，其结构iK fWF， -Cl， -Br， -1， 0H， -NH2， ,02或-N:!，根据底物不同，^ife度为10 200 mM;加入甘露醇的摩尔量与l发Sf七^I摩尔量的比例为(l 20): 1， 为(3~5): 1;根据红酵母还原酶制剂中酶含量的不同，视酶制剂纯度不同，酶制剂的加入量为(w/w);加入的辅酶可以^aS原型辅酶NADPH，也可以是氧化性辅酶NADP+，反应液中浓度为0.001 L0 mM，；缓冲液的pH值为7 11，驗范围为9 10。将上述反应混^t/在恒温环境中混合反应一段时间，反应驢为2(M(TC， 为 25~35°C;鹏结束后用有机翻(J魏反应液中顿的，，分离、iB^^有目标;^的 有棚歸lj，千燥后蒸发除去翻，即可获得目标产物。，本专利技术红酵TO原酶制剂催化羰m^/的不x^尔还原，反应体系中只需加入催化量的NADP+或NADPH以及一定fit价的甘露醇即可实现还原型辅酶NADPH的再生、循环 <顿，无须加入等齐糧昂贵的还原型辅酶NADPH。催化剂易于制备，反应底物浓度高， 产 取简便，光学纟艘高，具WI^子的X^用开发前景。附图说明图1为红酵雕跻鹏化光学活性手性仲醇妒的示意图； 图2红酵^ffi酶DEAE(一) 红酵 原酶制剂，其中同时含有羰基还原酶以及甘露醇脱氢酶。(二) 以下是用红酵職原酶制剂催化羰基化合物还原制备光学活性手性仲醇的叙但 例，用于说明本专利技术的方法，但并不限制本专利技术的内容和范围。红酵 原,品制备的^1例 取240g红酵母湿细胞悬浮于2 L Tris-HC1缓冲液中，缓冲液浓度为50 inM， pH为 7.5，其中含有100raMNaCl。用高压均质丰/TJ^彌胞破碎，破碎液高速离心，分离除去 细胞碎片。将离心上清液7賴卩至4。C，缓斷對半，力口入固体硫醱安粉末进行蛋白质沉淀，麟3519W疏^^^和度区间的蛋白质沉淀，冷冻千燥，获得红酵舰原Kf且酶制剂 2.1 g。红酵 原,品的纯化^| 例如 例1制备红酵TOS原酉辩且酶制剂，取0. 5 g粗酶制剂，溶解于20 ml Tris-HCl缓 冲液(10nM， pHS.O)中，用相同的Tris-HC1缓冲液(10 mM， pH 8. 0)透析除去硫^^安， 将透析后的酶mi样到DEAE-Toyopearl阴离子柱上，用含有ii^度NaCl0 M) 的Tris-HC1缓冲液(10 nM， pH8.0)进份划兑，ifeft含有羰基还原,n甘露醇雌酶活 力的组分。红酵^ffi酶部微化结果如图2戶际，图中 280 nm蛋白;^及光值； ■甘露醇脱氢酶；▲羰基还原酶，由此可见，大部分杂蛋白被分离除去。将羰基还原 辭口甘露本文档来自技高网...

【技术保护点】
红酵母还原酶制剂，其特征在于，其中同时含有羰基还原酶以及甘露醇脱氢酶。

【技术特征摘要】
1、红酵母还原酶制剂，其特征在于，其中同时含有羰基还原酶以及甘露醇脱氢酶。2、 权利要求1所述红酵母还原酶制剂的制备方法，包括以下步骤 收集发酵培养的红酵母细胞，破碎、离心，在上清液中加入硫酸铵进行硫酸铵沉淀，收集沉淀的酶蛋白，冷冻干燥得红酵母还原酶粗酶制剂；或者对硫 酸铵沉淀的酶蛋白进行柱层析纯化后，收集含有羰基还原酶和甘露醇脱氢酶的 洗脱液，冷冻干燥得部分纯化红酵母还原酶制剂。3、 用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法，包括以下步骤 取一定质量的红酵母还原酶制剂溶解于适合的缓冲液中，加入羰基化合物、甘露醇和催化量的辅酶进行反应，生成光学活性的手性仲醇。4、 根据权利要求3所述用红酵母还原酶制剂制备光学活性手性仲醇的方法，其 特征在于所述羰基化合物的结构通式为RiC0R2;其中R,代表-C6H5， -C孔X， 或者-(:狐;R2代表-CH -C腦,，-CH2X, -CH线X， X代表F， Cl， Br， I， 0H， NH2， N02，化中的任一种。5、 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘江，杨巍，朱月珍，陆帮荣，叶双庚，许建和，
申请(专利权)人：江苏华荣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]