一种构建cDNA文库的方法技术

本发明专利技术公开一种构建ｃＤＮＡ文库的方法，其特点是简单快速而且不需要核酸内切酶。该方法的主要步骤包括：（１）以总ＲＮＡ（或者ｍＲＮＡ）为模板，利用这对引物通过反转录合成ｃＤＮＡ第一条链。（２）利用这对引物通过Ｔａｑ　ＤＮＡ合成酶催化的ＰＣＲ合成ｃＤＮＡ第二条链。（３）将步骤（２）得到的ＰＣＲ产物通过ＤＮＡ连接酶直接与Ｔ－载体连接，然后转化大肠杆菌感受态，得到ｃＤＮＡ文库。本发明专利技术的方法构建ｃＤＮＡ文库成本极低，ＲＮＡ模板需要量很少，而且适用于任何来源生物样品ＲＮＡ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开，利用T-载体快速构建cDNA文库是 基因工程技术中的一种分离鉴定功能基因的方法，属分子生物学范畴。
技术介绍
构建cDNA文库是鉴定未知生物基因组功能基因的一种有效手段，从1975 年Rougeon等人第一次成功构建cDNA文库以来，各种构建文库的方法不断涌现， 技术手段也越来越成熟，其主要的技术手段不外乎包括采用polyd(T)寡聚糖 核苷酸与mRNA的poly (A)互补配对为引物，以mRNA为模板通过RNA反转录酶 催化合成第一条cDNA链。然后通过DNA聚合酶合成第二条cDNA链。为了将合 成的cDNA克隆到载体中，通常需要在双链cDNA两端加上两个带有特异酶切位 点的接头引物，另外为了在酶切接头引物时不至于将cDNA切断，往往需要将所 合成的cDNA甲基化。切割完成后连接到载体中，最后进行cDNA文库构建。这 些方法都涉及到接头引物和酶切等复杂程序，操作太繁琐，且成功率不是很高， 更不能轻易采用对微量宝贵样品建库。虽然最近也有采用噬菌体插入/切除位点 特异性重组系统(即GATEWAYTM系统)连接cDNA到载体的报道，但这种重组的效 率是有待提高的，而且本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建ｃＤＮＡ文库的方法，包括以下步骤：　１）以总ＲＮＡ或ｍＲＮＡ为模板，以ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１和ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２为引物，以Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ⅱ为反转录酶合成ｃＤＮＡ第一条链；　２）以ｃＤＮＡ第一条链为模板，以ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１和ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２为引物，以ＤＮＡ聚合酶通过ＰＣＲ扩增合成双链ｃＤＮＡ；　３）将步骤２）合成的双链ｃＤＮＡ直接通过Ｔ４　ＤＮＡ连接酶连接到Ｔ－载体中，将载体通过转化导入大肠杆菌，得到ｃＤＮＡ文库。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄惜，翟金玲，徐远峰，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]