一种构建cDNA文库的方法技术

本发明专利技术公开一种构建ｃＤＮＡ文库的方法，其特点是简单快速而且不需要核酸内切酶。该方法的主要步骤包括：（１）以总ＲＮＡ（或者ｍＲＮＡ）为模板，利用这对引物通过反转录合成ｃＤＮＡ第一条链。（２）利用这对引物通过Ｔａｑ　ＤＮＡ合成酶催化的ＰＣＲ合成ｃＤＮＡ第二条链。（３）将步骤（２）得到的ＰＣＲ产物通过ＤＮＡ连接酶直接与Ｔ－载体连接，然后转化大肠杆菌感受态，得到ｃＤＮＡ文库。本发明专利技术的方法构建ｃＤＮＡ文库成本极低，ＲＮＡ模板需要量很少，而且适用于任何来源生物样品ＲＮＡ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开，利用T-载体快速构建cDNA文库是 基因工程技术中的一种分离鉴定功能基因的方法，属分子生物学范畴。
技术介绍
构建cDNA文库是鉴定未知生物基因组功能基因的一种有效手段，从1975 年Rougeon等人第一次成功构建cDNA文库以来，各种构建文库的方法不断涌现， 技术手段也越来越成熟，其主要的技术手段不外乎包括采用polyd(T)寡聚糖 核苷酸与mRNA的poly (A)互补配对为引物，以mRNA为模板通过RNA反转录酶 催化合成第一条cDNA链。然后通过DNA聚合酶合成第二条cDNA链。为了将合 成的cDNA克隆到载体中，通常需要在双链cDNA两端加上两个带有特异酶切位 点的接头引物，另外为了在酶切接头引物时不至于将cDNA切断，往往需要将所 合成的cDNA甲基化。切割完成后连接到载体中，最后进行cDNA文库构建。这 些方法都涉及到接头引物和酶切等复杂程序，操作太繁琐，且成功率不是很高， 更不能轻易采用对微量宝贵样品建库。虽然最近也有采用噬菌体插入/切除位点 特异性重组系统(即GATEWAYTM系统)连接cDNA到载体的报道，但这种重组的效 率是有待提高的，而且用于重组的Clonas^酶非常昂贵，在推广上有一定难度。 总之，现在还没有-种既简单经济，又快速高效，既不需要大量RNA样品，又 能高通量、高成功率的构建cDNA文库的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，既不需要核酸内切酶也不 需要噬菌体插入/切除位点特异性重组系统的构建cDNA文库的高通量、高成功 率的简单方法。本专利技术的目的是这样实现的 包括以下步骤1、1) 以总RNA或mRNA为模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2为引物，以 Invitrogen公司的Superscript II为反转录酶合成cDNA第一条链；2) 以cDNA第一条链为模板，以SEQIDNo. l和SEQIDNo. 2为引物，以DNA 聚合酶通过PCR扩增合成双链cDNA;3) 将步骤2)合成的双链cDNA直接通过T4 DNA连接酶连接到T-载体中， 将载体通过转化导入大肠杆菌，得到cDNA文库。2、 步骤1 ) SEQ ID No. 1为一段寡聚脱氧核苷酸序列，3'末端为GGG，其余 序列为任意一段特异性接头引物序列。3、 步骤1 ) SEQ ID No. 2为一段寡聚脱氧核苷酸序列，3'末端为15_30个胸 腺嘧啶脱氧核苷T和VN序列，5'末端为明显不同于SEQ ID No. 1的任意一段 15-30bp的特异性接头引物序列。4、 步骤2)用于合成双链cDNA的DNA聚合酶为具有添加腺嘌呤脱氧核苷A粘 性末端功能的Taq DNA聚合酶。5、 步骤3)所述的T-载体指两端都带有突出胸腺嘧啶脱氧核苷T粘性末端的 载体。本专利技术的核心步骤为使用Taq DNA聚合酶通过PCR合成cDNA的第二条链， 利用Taq DNA聚合酶在DNA合成完成后的加尾特性，保证合成的双链cDNA两个 末端均为A粘性末端，这样的双链DNA可以在T4-DNA连接酶作用下和带有两个 T粘性末端的T-载体连接，之后通过转化完成cDNA文库的构建。如图1所示，该专利技术的具体实施步骤如下A.第一条链的合成 将以下药剂加入灭菌过的无菌离心管中1-3 ul RNA样品(大约l.Oug总RNA)lu 1 引物SEQ ID No. 1lul 引物SEQ ID No. 2加双蒸水至5li 1将离心管里的溶液充分混合并稍微离心使之聚集，然后72。C温浴2分钟，然 后放置冰上2min。然后加入以下试剂 2. 0 u 1 5X第一条链缓冲液1. 0 u 1 DTT (20 mM)1. 0 u 1 dNTP Mix (10 mM )1.0 ul SuperScriptII反转录酶 总体积为IO.O ul将离心管里的溶液充分混合并稍微离心使之聚集，然后42。C温浴60分钟。反 应完成后，将离心管放在冰上终止反应。 B.通过PCR合成cDNA第二条链将以下药剂加入灭菌过的无菌离心管中2 yl 第一条cDNA链80 ul H2010 y 110X PCR缓冲液2 11 1 50X dNTP Mix2 u 1 引物SEQ ID No. 12 u 1 引物SEQ ID No. 22 1 Taq Polymerase总体积为IOO Hi将离心管里的溶液充分混合并稍微离心使之聚集，然后放置到PCR仪里进 行PCR反应，反应程序为 95° C1 min<formula>formula see original document page 6</formula>反应完成后，将5u 1 PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳，以鉴定cDNA产物的 合成效果。如果想要获得大片段的cDNA文库，可以将全部PCR产物进行琼脂糖 凝胶电泳，然后根据需要将DNA片段进行琼脂糖凝胶回收，利用异丙醇和70% 乙醇纯化和浓縮后，才进行下面的T-载体连接，否则可以直接将双链cDNA用异 丙醇和70%乙醇纯化和浓缩之10 u 1总体积，在进行T-载体连接。C. 双链cDNA与T-载体的连接10 ul 浓縮后的双链cDNA5 u 1 T-载体3 u 1 T4 DNA连接酶2 u ] T4 DNA连接酶缓冲液混合后在16° C过夜连接。D. 将连接物与大肠杆菌电激点击感受态混合，然后在BioRad MicroPulser 电转仪上进行电激转化，获得cDNA文库。该专利技术的主要优点是(l)RNA使用量少，原则上只需要0.05-L0 ug的 总RNA就可满足构建文库的要求。(2)操作简单，因为5'接头引物在合成cDNA 第一条链时利用S叩erScriptII的加尾功能和底物转换巧妙添加上去，而3'端 引物则直接添加在Poly d(T)上，cDNA第二条链的合成则通过PCR扩增完成。 此外，合成双链cDNA时巧妙利用Taq DNA聚合酶的加尾功能，使PCR产物自动 带有粘性A末端，可以高通量地与带有T粘性末端的T-载体直接连接，避免接 头的酶切过程，所以操作简单。(3)操作简洁，合成--次cDNA第-条链可以进行5次双链cDNA的PCR扩增，保证构建文库的高成功率。(4)应用此方法构建文库几乎没有使用任何昂贵试剂，所以费用低廉。附图说明图l为本专利技术的技术路线图2为PCR扩增得到红树的双链cDNA，取5 u 1在1. 2。/。的琼脂糖凝上进行 电泳，最左边为lkb DNA marker;图3为红树cDNA文库单菌落PCR扩增结果，PCR产物在1. 2%的琼脂糖凝上 进行电泳，最左边为lkb DNA marker。 具体实施例方式构建红树植物红海榄的cDNA文库红树植物由于常年生长在海边，具有很强的耐盐耐涝能力，其组织内的内 含物也特别丰富，如多糖和蛋白，大量内含物会增加提取红树的RNA的难度和 影响提取RNA的质量，因此构建高质量的红树的cDNA文库难度就相对较大，利 用本专利技术，我们按照下列步骤构建红树cDNA文库。本专利技术对SEQ ID No. 1引物的要求为 一段寡聚脱氧核苷酸序列，3'末端 为GGG，其余序列为任意一段特异性接头引物序列。本专利技术对SEQ ID No. 2引物 的要求为 一段寡聚脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建ｃＤＮＡ文库的方法，包括以下步骤：　１）以总ＲＮＡ或ｍＲＮＡ为模板，以ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１和ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２为引物，以Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ⅱ为反转录酶合成ｃＤＮＡ第一条链；　２）以ｃＤＮＡ第一条链为模板，以ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１和ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２为引物，以ＤＮＡ聚合酶通过ＰＣＲ扩增合成双链ｃＤＮＡ；　３）将步骤２）合成的双链ｃＤＮＡ直接通过Ｔ４　ＤＮＡ连接酶连接到Ｔ－载体中，将载体通过转化导入大肠杆菌，得到ｃＤＮＡ文库。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄惜，翟金玲，徐远峰，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]