一种基于HaCaT细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法技术

本发明专利技术提供了一种基于HaCaT细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法，属于外用材料检测领域。所述方法包括将HaCaT细胞先后经过不同浓度的纳米二氧化钛溶液和紫外线处理，测定细胞存活率；选择使HaCaT细胞存活率达到在50％～90％的纳米二氧化钛溶液的浓度作为潜在危险浓度，结合紫外线处理，导致细胞中唾液酸表达水平与细胞中ROS的水平均发生一致变化；最后通过检测唾液酸的表达水平的变化判断潜在危险浓度纳米二氧化钛对细胞损伤程度的影响，从而得到一套标准的纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法。本发明专利技术为纳米二氧化钛的安全使用提供可靠的科学依据，也为其他纳米材料的安全性评价提供参考。

A method for evaluating the skin safety of nano titanium dioxide based on HaCaT cells

The invention provides a method for evaluating the skin safety of nanoscale titanium dioxide based on HaCaT cells, which belongs to the field of detection of external materials. The method includes HaCaT cells after different concentrations of nano titanium dioxide solution and ultraviolet treatment, cell viability was measured by HaCaT; select the cell survival rate reached 50% ~ 90% of the concentration of nano titanium dioxide solution as potential risk concentration, combined with ultraviolet radiation treatment, resulting in cell sialic acid expression level and the level of ROS in cells were unanimous change; finally, by detecting the expression of sialic acid levels to determine potential dangerous concentrations of nano titanium dioxide the effect on the degree of cell injury, skin safety evaluation method to obtain a set of standard nano-TiO2 two. The invention provides a reliable scientific basis for the safe use of nanoscale titanium dioxide, and provides a reference for the safety evaluation of other nanomaterials.

【技术实现步骤摘要】
一种基于HaCaT细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法
本专利技术属于外用材料检测领域，具体涉及一种基于HaCaT细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法。
技术介绍
纳米TiO2(nano-TiO2)是一种广泛使用的纳米材料，主要用于化妆品、医药、环保、涂料等领域。纳米材料因为其独特优势如比表面积大、粒径小，在各行各业得到广泛使用，尤其是化妆品行业中，因为纳米二氧化钛具有吸收散射紫外光的特性，所以它被广泛运用到防晒霜当中。目前全世界每年用于化妆品的纳米TiO2已达数千吨。也正是因为它的这些特性，可能会带来更大的危害，纳米二氧化钛对皮肤的安全性研究一直受到科研人员高度重视。纳米TiO2的危害主要在于它具有光催化性，尤其在紫外光下，它会产生大量的氧自由基(ROS)，包括HO·、O2·－和1O2.正常条件下，ROS对维持细胞正常功能，在胞内、胞间传递信号有重要作用；但是当氧自由基水平升高，远远超过自身正常水平，会给细胞损伤，破坏正常结构，影响功能。目前对于纳米二氧化钛在细胞水平的研究主要在于，ROS会造成细胞膜完整性破坏，造成脂质过氧化，DNA断裂，破坏线粒体的完整性，造成细胞骨架损坏，从而影响细胞的正常功能。但是作为细胞主要成分之一的糖类却鲜少有人研究它在纳米材料毒性中发生怎样的变化。糖以共价键与蛋白质或者脂质结合，形成糖蛋白，蛋白聚糖和糖脂，它们参与细胞识别与分化，细胞粘附，迁移等方面发挥作用。例如Yin等人在2012年就发现nano-TiO2造成的光毒性损伤随着紫外光(UV)的剂量和纳米材料的剂量增加而增加；粒径越小造成的损伤越大。它在UV光下会产生大量的ROS，造成脂质蛋白质过氧化诱导细胞凋亡。目前，报道的对于纳米二氧化钛的皮肤安全评价方法，涉及系统生物学层面，通过建立代谢网络，观察细胞代谢网络中不同代谢物的变化，寻找二氧化钛纳米颗粒影响细胞皮肤安全性的代谢标志物和作用靶点，全面解析二氧化钛纳米颗粒诱导细胞损伤的内在代谢通路。例如专利公开号为CN102373261A的专利公开了纳米二氧化钛的细胞安全评价，建立模型，根据细胞中差异代谢物的变化，构建代谢网络，然后探讨二氧化钛颗粒影响细胞的代谢机制，综合评价二氧化钛纳米颗粒与细胞皮肤安全性之间的关系。所述方法可以快速、准确地寻找到与二氧化钛纳米颗粒诱发代谢网络紊乱相关的关键代谢物，但是所述方法需要分析多个代谢途径的变化和统计分析，方法复杂，不能直接反应出安全评估结果。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于HaCaT细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法，步骤简单，能够直接反应出安全评估的结果。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种基于HaCaT细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法，包括以下步骤：1)将HaCaT细胞接种在细胞培养基中培养，待所述HaCaT细胞生长至对数期进行消化，消化后的HaCaT细胞悬液进行贴壁培养24h，得到贴壁生长的HaCaT细胞；2)将纳米二氧化钛分散在PBS缓冲液中，超声，得到纳米二氧化钛溶液；3)将所述步骤2)中的纳米二氧化钛溶液稀释成若干浓度，分别加入到所述步骤1)得到的贴壁生长的HaCaT细胞中，培养21～22h，再紫外线照射30～60min；4)将所述步骤3)中紫外线照射后的HaCaT细胞进行培养，将培养后的HaCaT细胞在MTT溶液中继续培养；将培养后的HaCaT细胞在DMSO溶液中在492nm波长下测定吸光值，得到实验组结果；设置调零组，所述调零组结果为仅先后包含DMEM、MTT溶液和DMSO的溶液测得的吸光度；设置实验对照组，所述实验对照组结果为将HaCaT细胞依次经DMEM，MTT溶液，DMSO溶液处理后测得的吸光度值；将所述实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式I所示公式计算得到细胞存活率；所述细胞存活率＝(ODexp-ODneg)/(ODcon-ODneg)×100％式I其中ODexp代表实验组吸光度值，ODneg代表调零组吸光度值，ODcon代表实验对照组吸光度值；根据实验组中细胞存活率在50％～90％的纳米二氧化钛溶液的浓度作为潜在危险浓度；5)用所述步骤4)中得到的潜在危险浓度的纳米二氧化钛溶液处理所述步骤1)中消化后的对数期HaCaT细胞21小时，得到的处理后的HaCaT细胞依次进行紫外线处理30～60min、继续培养2h、第一清洗、固定，向固定后的HaCaT细胞中加入FITC标记凝集素溶液，依次进行孵育、染色、第二清洗，测定清洗后的HaCaT细胞的荧光强度，得到HaCaT细胞的唾液酸表达水平；设置调零组和实验对照组；所述调零组结果为仅先后包含纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后的溶液测得的荧光强度；所述实验对照组结果为将HaCaT细胞依次经纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后测得的荧光强度；将实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式Ⅱ中计算，得到相对荧光强度；相对荧光强度＝(MFexp-MFneg)/(MFcon-MFneg)×100％式Ⅱ其中MFexp代表实验组荧光强度，MFneg代表调零组荧光强度，MFcon代表实验对照组荧光强度；通过分析经过不同浓度下的纳米二氧化钛溶液和紫外光处理的HaCaT细胞中唾液酸表达水平与对照组之间是否有显著性差异，来判断细胞的损伤程度；所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。优选的，所述步骤3)和步骤5)中紫外线照射的功率为6～10W；所述紫外线的波长为365nm，所述紫外线的光源和HaCaT细胞之间距离为9～11cm。优选的，所述步骤5)中FITC标记凝集素溶液为FITC标记的接骨木素溶液；所述FITC标记的接骨木素溶液的质量浓度为8～12μg/mL。优选的，所述步骤5)中第一孵育的时间为50～70min。优选的，所述步骤5)中第一清洗和第二清洗用溶液为PBS缓冲液。优选的，所述步骤5)中固定用溶液为质量浓度为4％的多聚甲醛溶液；所述固定的时间为12～17min。优选的，其特征在于，所述步骤5)中测定清洗后的HaCaT细胞的荧光强度的激发波长为488nm。优选的，所述步骤1)中消化后的HaCaT细胞悬液的细胞浓度为1x105/mL；所述步骤3)中纳米二氧化钛溶液的梯度浓度为10～1000μg/mL；所述纳米二氧化钛溶液的加入体积与HaCaT细胞贴壁培养时细胞培养基的体积相同。优选的，所述步骤1)中细胞培养基是以DMEM完全培养基为基础培养基，包含有质量百分含量为1％的青霉素、质量百分含量为1％的链霉素和质量百分含量为10％胎牛血清。优选的，所述步骤2)中纳米二氧化钛的粒度为20～800nm；纳米二氧化钛的质量浓度在10～1000μg/mL。本专利技术提供了一种基于HaCaT细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法，相较于传统的纳米二氧化钛的生物性评价方法主要针对遗传物质，蛋白质，脂质的变化以及生物学功能的影响，本专利技术的纳米二氧化钛的生物性评价方法是基于纳米二氧化钛在紫外光条件下诱导细胞损伤的多糖类物质(唾液酸属于多糖类物质)的变化，分析其变化的原因，有助于得到有效的评价纳米二氧化钛细胞生物性的手段和方法。通过本专利技术的实验结果可以看出，纳米二氧化钛材料不仅会对DNA、蛋白质、脂质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于HaCaT细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法，包括以下步骤：1)将HaCaT细胞接种在细胞培养基中培养，待所述HaCaT细胞生长至对数期时进行消化，消化后的HaCaT细胞悬液进行贴壁培养24h，得到贴壁生长的HaCaT细胞；2)将纳米二氧化钛分散在PBS缓冲液中，超声，得到纳米二氧化钛溶液；3)将所述步骤2)中的纳米二氧化钛溶液梯度稀释成若干浓度，分别加入到所述步骤1)得到的贴壁生长的HaCaT细胞中，培养21～22h后，再紫外线照射30～60min；4)将所述步骤3)中紫外线照射后的HaCaT细胞进行培养，将培养后的HaCaT细胞在MTT溶液中继续培养；将MTT溶液培养后的HaCaT细胞在DMSO中492nm波长下测定吸光值，作为实验组结果；设置调零组，所述调零组的结果为仅先后包含DMEM、MTT溶液和DMSO的溶液测得的吸光度；设置实验对照组，所述实验对照组的结果为将HaCaT细胞依次经DMEM、MTT溶液和DMSO溶液处理后测得的吸光度值；将所述实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式I所示公式计算得到细胞存活率：所述细胞存活率＝(ODexp‑ODneg)/(ODcon‑ODneg)×100％式I；其中ODexp代表实验组吸光度值，ODneg代表调零组吸光度值，ODcon代表实验对照组吸光度值；根据实验组中细胞存活率在50％～90％所用纳米二氧化钛溶液的浓度作为纳米二氧化钛溶液的潜在危险浓度；5)用所述步骤4)中得到的潜在危险浓度的纳米二氧化钛溶液处理所述步骤1)中消化后的对数期HaCaT细胞21小时，得到处理后的HaCaT细胞依次进行紫外线处理30～60min、继续培养2h、第一清洗和固定，向所述固定后的HaCaT细胞中加入FITC标记凝集素溶液，再依次进行孵育、荧光染色和第二清洗，测定清洗后的HaCaT细胞的荧光强度，得到HaCaT细胞的唾液酸表达水平；设置调零组和实验对照组；所述调零组结果为仅先后包含纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后的溶液测得的荧光强度；所述实验对照组结果为将HaCaT细胞依次经纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后测得的荧光强度；将实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式Ⅱ中计算，得到相对荧光强度；相对荧光强度＝(MFexp‑MFneg)/(MFcon‑MFneg)×100％式Ⅱ其中MFexp代表实验组荧光强度，MFneg代表调零组荧光强度，MFcon代表实验对照组荧光强度；通过分析经过不同浓度下的纳米二氧化钛溶液和紫外光处理的HaCaT细胞中唾液酸表达水平与对照组之间是否有显著性差异，来判断细胞的损伤程度；所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。...

【技术特征摘要】
1.一种基于HaCaT细胞对纳米二氧化钛的皮肤安全性评价方法，包括以下步骤：1)将HaCaT细胞接种在细胞培养基中培养，待所述HaCaT细胞生长至对数期时进行消化，消化后的HaCaT细胞悬液进行贴壁培养24h，得到贴壁生长的HaCaT细胞；2)将纳米二氧化钛分散在PBS缓冲液中，超声，得到纳米二氧化钛溶液；3)将所述步骤2)中的纳米二氧化钛溶液梯度稀释成若干浓度，分别加入到所述步骤1)得到的贴壁生长的HaCaT细胞中，培养21～22h后，再紫外线照射30～60min；4)将所述步骤3)中紫外线照射后的HaCaT细胞进行培养，将培养后的HaCaT细胞在MTT溶液中继续培养；将MTT溶液培养后的HaCaT细胞在DMSO中492nm波长下测定吸光值，作为实验组结果；设置调零组，所述调零组的结果为仅先后包含DMEM、MTT溶液和DMSO的溶液测得的吸光度；设置实验对照组，所述实验对照组的结果为将HaCaT细胞依次经DMEM、MTT溶液和DMSO溶液处理后测得的吸光度值；将所述实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式I所示公式计算得到细胞存活率：所述细胞存活率＝(ODexp-ODneg)/(ODcon-ODneg)×100％式I；其中ODexp代表实验组吸光度值，ODneg代表调零组吸光度值，ODcon代表实验对照组吸光度值；根据实验组中细胞存活率在50％～90％所用纳米二氧化钛溶液的浓度作为纳米二氧化钛溶液的潜在危险浓度；5)用所述步骤4)中得到的潜在危险浓度的纳米二氧化钛溶液处理所述步骤1)中消化后的对数期HaCaT细胞21小时，得到处理后的HaCaT细胞依次进行紫外线处理30～60min、继续培养2h、第一清洗和固定，向所述固定后的HaCaT细胞中加入FITC标记凝集素溶液，再依次进行孵育、荧光染色和第二清洗，测定清洗后的HaCaT细胞的荧光强度，得到HaCaT细胞的唾液酸表达水平；设置调零组和实验对照组；所述调零组结果为仅先后包含纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后的溶液测得的荧光强度；所述实验对照组结果为将HaCaT细胞依次经纳米二氧化钛溶液、紫外照射和荧光染色，孵育、清洗后测得的荧光强度；将实验组结果、调零组结果和实验对照组结果代入式Ⅱ中计算，得到相对荧光强度...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫，任园园，卢群伟，饶荣，刘旭涵，谭熙，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42