本发明专利技术涉及溶藻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）的一种重组外膜蛋白（ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ＶＡ０７６０的表达和疫苗组份的作用功能。本发明专利技术通过克隆溶藻弧菌重组外膜蛋白ＶＡ０７６０基因、表达及纯化，纯化产品可以显著地提高鱼类对溶藻弧菌、荧光假单胞菌等病原菌的抵抗力。可作为亚单位疫苗的候选靶位，且对控制弧菌感染的免疫学防治具有十分重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及溶藻弧菌(WZvvo"/g/'"o/"/"")表达的一种外膜蛋白(outer membrane protein, OM protein) VA0760的免疫调节功能。
技术介绍
溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处，并且数量居海水类弧菌之首，对于溶藻弧 菌致病微生物，研究的重点就是免疫学分析，阐明其致病机理并找出有效的防治方法，防治 的办法主要包括药物即抗生素防治以及免疫防治，其中抗生素虽然在最初的使用中取得了巨 大的进展，然而随着抗生素的广泛使用，也出现了一系列的相关问题， 一方面抗生素的不合 理使用，增加抗生素耐药菌的产生，细菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐药性而人为地 加大剂量，加剧耐药性的产生。因此，研制以具有免疫保护作用的高效中和抗原为成分的疫 苗具有广阔的应用前景。在各种动物疾病的防治中，疫苗的使用是一个具有低成本、高效的方法，并且已经有部 分疫苗得到大规模使用并取得了不错的防治效果。疫苗种类很多，以细菌为例，包括全菌疫 苗、亚单位疫苗以及DNA疫苗等。从实际应用的情况来看，全菌疫苗虽然具有制作相对简 单而且成本也较低的优点，但它也存在不少由于使用全菌体而固有的一些缺点。如减毒全f^ 疫苗可能出现菌株突变而导致的毒性恢复等不良后果；灭活全菌疫苗则往往由于对细菌的灭 活过程而导致一些免疫保护基团活性的改变，而影响免疫保护的效果。而且对全菌疫苗来说， 由于细菌成分的复杂性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，会导致机体产生不良反 应。并且常规制得的全菌疫苗免疫保护效果不理想。然而，全菌疫苗仍然是目前最为主要的 疫苗种类。其原因可能与高效中和抗原的发现和鉴定困难有关。随着基因组学、蛋白质组学和转录分布图技术的发展，这就为细菌疫苗提供了新的契机。 基因工程疫苗由于具有高效、且摆脱了传统疫苗的种种缺点，成为疫苗研究的重点，具有广 阔的应用与开发前景。外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的主要成分之一，由于外膜蛋白直接面 对宿主的体液及组织，细菌利用外膜蛋白进行黏附、侵入和炎症等生理活动，更容易被宿主 识别作为攻击目标，使得革兰氏阴性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可以刺激体液 免疫，而且对细胞免疫亦有刺激作用。近年来，细菌的一些外膜蛋白已经被证实具有良好的 免疫原性，用其制备基因工程疫苗具有良好的前景。如在大肠杆菌中发现外膜蛋白OmpX的免疫保护功能。但在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的溶藻 弧菌外膜蛋白VA0760的免疫调节功能。本专利率先采用分子克隆和免疫学等现代生物学技术，以溶藻弧菌为研究对象，对外膜 蛋白基因VA0760进行克隆、表达和纯化，并在此基础上深入研究其免疫保护性。免疫和攻 毒实验结果表明溶藻弧菌的外膜蛋白VA0760显示出对溶藻弧菌较高的免疫保护作用。其相 对免疫保护率(RPS)为75%，此外还显示出对荧光假单胞菌的交叉免疫原性，其免疫保护 率(RPS)达到52.6%。这些结果说明VA0760可作为疫苗组分。
技术实现思路
外膜蛋白具有良好的免疫原性，对细胞免疫和体液免疫均有刺激作用。本专利技术涉及通过 对表达的溶藻弧菌外膜蛋白VA0760免疫保护性以及免疫交叉性的分析，发现免疫鲫鱼后可 以显著提高对重要致病菌溶藻弧菌以及荧光假单胞菌的抵制力。初步评价其作为候选疫苗的 可行性，对水产疾病的防治具有重要意义。 附图说明图1. VA0760基因PCR产物0.8%琼脂糖凝胶电泳分析图2. pET-28a- VA0760重组子的双酶切鉴定图3.克隆子BL21-pET-28a- VA0760在五.co/Z-BL21中的诱导表达图4. SDS-PAGE分析纯化的重组蛋白.lane 1:克隆子BL21-pET-28a- VA0760诱导表达上清；lane 2:纯化的重组蛋白具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不 用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例 如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1溶藻弧菌外膜蛋白VA0760基因的克隆和鉴定 1.溶藻弧菌VA0760基因的扩增由于溶藻弧菌基因的全序列还未测定，目前也无该菌的VA0760基因序列报道。鉴于副 溶血弧菌已完成全序列测定，并于2006年3月在数据库GenBank (BA000031)公布，我们 按其数据库上已公布的VP0760序列设计了 VA0760基因引物，用于溶藻弧菌VA0760的PCR扩增。所设计的引物是上游引物5'-ATAge^ECCATGTCTTACCTAAAGAAAAGCC-3'; 下游引物5，- CGCAAGCTTTTAGAAGTAGTATTCAAC-3':横线所示为酶切位点，上游引 物引入5amH/酶切位点，下游引物引入/^>^///酶切位点。使用细菌基因组DNA提取试剂 盒(TIANGEN公司)，按照试剂盒内的使用说明书提取溶藻弧菌的全基因组DNA作为模板， 采用上述引物进行PCR扩增，图1所示PCR扩增结果。从图可见，基因扩增产物为单一特 异条带，va0760基因约1119bp，与预计的片段大小相当。2、溶藻弧菌va0760基因的克隆、筛选和鉴定将基因PCR产物使用0.8。/。琼脂糖/溴化乙锭凝胶进行电泳，通过新配置的琼脂糖凝胶电 泳纯化，按购自TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)的说明书进行 回收。用干净的、锋利的刀片，在短波长紫外灯下，切下目的PCR扩增片段，尽可能地切除 多余的胶，置于干净、已称重的离心管中，称重并记录切下目的胶的重量；然后按照说明书 的步骤，依次加入各种溶液、离心、过柱、洗脱等，最后得到基因PCR回收产物，置于-20 'c保存。取少量进行回收效果电泳检测。待基因PCR扩增产物回收后，分别采用相应的限制性内切酶^""^/浙//7^////(1^&1"3 公司)进行双酶切，同时对载体pET-28a (Novagen公司)进行双酶切(37'c酶切过夜)， 酶切后使用乙醇沉淀回收。方法如下向酶切体系加入1/10体积的NaAc (3M， pH5.2)和 2.5倍体积的无水乙醇，经-2(tc静置60min后，12000卬m离心15min，弃上清，加500 、1 70 %的乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清，重复洗涤一次，洗涤完后小心地倒尽液体， 用滤纸吸尽乙醇，置超净台中自然风干，风干后直接溶于适量的去离子无菌水。将两者回收后加入连接酶(Takara公司)，调节水温16°c，之后连接过夜。将连接产 物与约100(11/)//5 感受态细胞混合，冰浴30min后42。c热激90s，并立即冰浴5min，加新 鲜LB培养基补足体积至lml，置于37'C摇床150rpm缓慢培养45min，取培养液10000rpm 离心30s，弃85(^1上清，余下菌液重悬均匀，涂布含卡那霉素(100 、g/ml) LB平板，待 转化液被平板完全吸收后，于37'C倒置培养12 16小时本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种溶藻弧菌外膜蛋白ＶＡ０７６０，其氨基酸序列序列表４００＜２＞所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭宣宪，熊莜鹏，李惠，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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