疫苗制造技术

本发明专利技术提供新的基本不分裂形式的ｇｐ１６０，以及含有ｇｐ１６０或其衍生物，配有３－ＤＭＰＬ佐剂的疫苗制剂。组合物可用于对ＨＩＶ传染的免疫治疗的和免疫预防的处置。（*该技术在2011年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新的疫苗和药用制剂以及涉及其制备和在处置爱滋病中的使用。尤其是本专利技术涉及使用gp160或其衍生物，包括在疫苗中的新型gp160，配3-D单磷酰基类脂质A佐剂。反转录病毒，即Retroviridae系内的病毒，是在核结构内具有卷曲病毒粒子和具有RNA作为遗传物质的约150nm的被膜、二十面的病毒的一大系。该系包含致癌病毒，如肉瘤和白血病病毒，某种免疫缺乏病毒和晶状病毒(lentiviruses)。人类免疫缺乏病毒型Ⅰ(HIV-1)是后天免疫缺乏综合症(也被称爱滋病)的病原。这种反转录病毒有一复杂基因组织，包括长末端重复(LTRS)，gag、pol和env基因以及其它基因。这种反转录病毒带有许多病毒抗原，这些病毒抗原是单独的或一起地作为能诱导保护性免疫应答疫苗的潜在候补者。HIV-1被膜蛋白是作为一种多蛋白前身而合成的，随后它在感染细胞内糖基化而得到分子量为160kDa(gp160)和糖蛋白，它通过蛋白水解而成为gp120外扩蛋白和gp41转膜(transmanbrane)蛋白。一种原病毒HIV的DNA编码区可以由文献所报导的任何几种免疫缺乏病毒基因克隆来制备。例如参阅Shaw等人，Science 2261165(1984);Kramer等人，Science 2311580(1986)。或者，一种免疫缺乏病毒基因克隆可以由通过标准DNA克隆技术由临床样品中分离的病毒中制备。例如参阅Gallo等人，美国专利US4520113;Montagnier等人，美国专利US4708818。HIV-BH10-2的原病毒DNA顺序描述于Ratner等人的“Human Retroviruses and AIDS”1989，HIV Sequence Database ed.Gerald Meyers，Los Alamos National Laboratory。顺序是8932 bp长，env基因是位于5580-8150，而其中分裂位点在7088和7112，相当于氨基酸503和511(在这些残基后分裂)(编号按照Los Alamos数据库)根据本专利技术，提供了HIV gp160，它已改性以在位置502和510分别提供除赖氨酸或精氨酸外的氨基酸。赖氨酸的合适置换是亲水性和大小与赖氨酸相类的那些，如组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸。其中，优选的氨基酸是谷氨酸。优选的蛋白是由于突变引入的非分裂的以及能诱出交互中和抗体的，它是取决于蛋白的正确折叠。本专利技术提供的专利技术改性蛋白最好是寡聚形式的。特别是具有相对分子量640kDa。基于分子量gp160单体，这种形式认为是四聚的。这是有利的，因为病毒表面蛋白必然以寡聚物存在，它在体内形成由病毒表面突出的刺突。正如许多中和表位是构象的，很清楚重要的是尽可能接近地模拟抗原形式使用之天然地呈现，因为这将提供最有关的免疫应答。在优选的实施方案中本专利技术提供的专利技术改性蛋白是以寡聚的亚基本纯的形式。基本纯是指至少75%纯，更优选的应90%纯，最优选的为99%纯。在另一方面本专利技术提供了根据本专利技术制备改性HIV gp160的方法，该方法包括在一重组体真核宿主细胞中表达编码所述改性蛋白的DNA以及回收改性蛋白产品。DNA聚合物含有编码改性蛋白的核苷酸顺序，它也形成了部分本专利技术。本专利技术的重组体DNA分子可以根据本专利技术通过将适宜的单-、双-或寡聚核苷酸单元缩合而制备。制备可以用化学法或酶催化法或用两者相结合的方法，看适宜而定在体内或体外进行。这样，DNA分子可以通过相当的DNA片段的酶促络合形成作用，通过描述于D.M.Roberts等人的Biochemistry 1985，24，5090-5098中的常用方法而制备。DNA片段可以通过含有核苷酸的必要顺序的DNA用适当限制性内切酶的消化作用，通过化学合成，通过酶催化的聚合作用或通过两者相结合的方法而制得。用限制性内切酶的消化作用可以在适宜的缓冲液，在20℃-70℃温度下，一般在50μl或更少的体积中用0.1～10μgDNA进行实施。DNA酶催化的聚合作用可以在体外，使用一种DNA聚合酶，诸如DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)在一种含有三磷酸核苷dATP、dCTP、dGTP和dTTP(视需要而定)的适宜缓冲液中，在10°～37℃温度下，一般在50μl或更少体积中进行。片段可以使用Taq聚合酶通过聚合酶链反应而聚合和放大(参阅PCR Protocols 1989-aguide to Methods and Applications，Ed.M.A.Innis等人，Acadamic Press)。DNA片段的酶催化连接可以使用一种如T4 DNA连接酶的DNA连接酶，在适宜的缓冲液中，在4℃～室温的温度下，一般在50μl或更少体积中进行。DNA分子或片段的化学合成可以通过通常的磷酸三酯、亚磷酸盐或氨基磷酸酯(phosphoramidite)化学，使用固相技术进行实施，这些技术描述于‘Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory Manual’(ed.H.G.Gassen and A.Lang)，Verlag Chemie，Weinheim(1982)，或描述于其它科学出版物中，例如，M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.sproat和R.C.Titmas，Nucleic Acids Research，1982，10，6243;B.S.Sporat和W.Bannwarth，Tetrahedron Letters，1983，24，5771;M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters，1980，21，719;M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，Journal of the American Chemical Society，1981，103，3185;S.P.Adams等人，Journal of the American Chemical Society，1983，105，661;N.D.Sinha，J.Biernat，J.McMannus，和H.Koester，Nucleic Acids Research，1984，12，4539;和H.W.D.Matthes等人，EMBO Journal，1984，3，801。优选的是使用一种自动DNA合成器。编码改性蛋白的DNA聚合物可以使用一般方法通过将编码未改性蛋白的cDNA进行位点定向诱变而制备，这些方法描述于G.Winter等人的Nature，1982，299，756-758或Zoller和Smith 1982;Nucl.Acids Res，10，6487-6500。本专利技术也涉及含有本专利技术重组体DNA分子的载体，并涉及含有所述载体的重组体疫苗病毒。载体的制备可以根据本专利技术，通过分裂一载体而提供具有完整复制子的线性DNA节片并将所说线性节片与一个或多个DNA分子连接，它们与所述线性节片一起完本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备改性ＨＩＶｇｐ１６０蛋白的方法，其中在位置５０２和５１０分别提供的是除赖氨酸或精酸以外的氨基酸，方法包括在重组体真核宿主中表达编码所说蛋白的ＤＮＡ顺序。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：F范韦南代尔，M施拉奥伊，C布鲁克，M弗朗科特，S库默特，
申请(专利权)人：史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]