本发明专利技术提供了一种自Ｄｉｇｕｅｔｉａｃａｎｉｔｉｅｓ蜘蛛毒液中可分离到的高效杀虫多肽，制备和应用这些杀虫剂的方法，及编码这些高效杀虫多肽的ＤＮＡ。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术与有杀虫效力的多肽有关。特别与如下有关可从Diguetia蜘蛛毒分离到的有杀虫效力的多肽，编码这些有杀虫效力多肽的DNA，生产上述多肽的方法和控制无脊椎害虫的方法。近年来，公众已经深刻地意识到与使用人工合成杀虫剂有关的环境危害和对哺乳动物的毒性。因此，这些杀虫剂的使用已经迅速地下降。然而，对有效昆虫控制的需要并未改变。这就促使研究人员去建立新的控制昆虫的方法。最广泛使用的微生物杀虫剂来自细菌Bacillus thuringiensis(以后简称B.t.)。这种细菌制剂用于控制多种吃叶的鳞翅目幼虫。日本甲虫和蚊子。Karamata等1989年1月10日发表的美国专利号4，797，279阐明了含编码B.t.Kurstakiδ-内毒素的基因和编码B.t.tenebrionis δ-内毒素的基因的杂合细菌细胞以及它们的制备方法。这些杂合子能有效抵抗对B.t.Kurstaki品系敏感的害虫以及对B.t.tenebrionis品系敏感的害虫。一般来说，这些杂合子在杀虫力水平或杀虫力的范围或上述两方面具有有用的杀虫特性优于物理混合母代品系所观察到的结果。把含这些微生物的杀虫混合物以杂合子的有效杀虫量施于昆虫或它们的生存环境中就可以抵抗昆虫。另一B.t.菌的衍生物发表于欧洲专利申请发行编号为0 325 400A1，属于Gilroy和Wilcox。这项专利技术与对鳞翅目昆虫有毒性的杂合毒性基因有关。特别地，此专利技术含有杂合的δ-内毒素基因。它有一部分的B.t.var.Kurstaki HD-73毒素基因和一部分的B.t.var.Kurstaki品系HD-1的毒素基因。此专利技术阐述了这种编码有抗鳞翅目昆虫活性蛋白的杂合毒素基因(DNA)。欧洲专利申请发行号0 340 948(属于Wilcox等)，也应用了B.t.菌的杀虫特性。此专利技术涉及杂合杀虫毒素，它们是为了制备具抗鳞翅目昆虫活性的杂合B.t.毒素而把昆虫肠表皮细胞识别B.t.基因区域与鳞翅目毒素B链融合而产生的。专利技术指出也许能用这种杂合B.t.基因插入植物中或克隆进棒状病毒中来产生可回收的毒素。或者，这种含杂合B.t.基因的宿主可作为杀虫剂，直接施于靶昆虫的生存环境中。在寻找杀虫复合物的过程中，蝎子毒被认为是一种可能的具杀虫特性复合物的来源。两种昆虫选择性毒素已从蝎子Leiurus quingquestriatus quinquestriatus毒液中分离出来，由zlotkin等发表在Arch Biochem and Biophysics，240877-87(1985)，题目为《蝎毒中激活性和抑制性昆虫毒素都影响钠传导并有共同的结合位点》。有关它们的化学和药理性质研究表明一种毒素诱导蝇幼虫快速的激动收缩麻痹，另一种毒素诱导慢速抑制松弛麻痹。两者都影响钠传导。加拿大专利2，005，658，由Zlotkin等1990年6月19日发表，阐明了一种来源于蝎子Leiurus quinquestriatus hebraeus Buthi-nas，Buthidae的有效杀虫蛋白。这项专利技术中毒液被冻干并分部分离。对幼虫有最高毒性且对鼠有最低毒性的那部分被进一步纯化，最终产物称为“Lqh P35”。Grishin(Shemyakin Institute of Bioorganic Chemistry，USSR Academy of Seiences，Moscow 117988，GSP-1，USSR)发表的《Buthus eupeus和Lucosa singoriensis毒液中的毒素成分》揭示了四种从蝎Buthus eupeus毒液中分离到的昆虫毒素。文章还阐述了塔兰图拉毒蛛Lucosa singoriensis毒液中毒素成分的分离和鉴定。原毒液对昆虫是无毒的。相应于有关多种杀虫性混合物的研究和发展，研究人员致力于建立产生杀虫基因并把它们引入靶害虫的方法。美国专利编号4，879，236，由Smith和Summers于1989年11月7日发表，涉及了这样一种方法，把一个被选择基因与一个棒状病毒启动子相连引入棒状病毒的基因组中从而产生了一个重组棒状病毒的表达载体。它能在昆虫细胞内表达出被选择基因。这种方法包括切割棒状病毒DNA产生一段DNA含有polyhedrin基因或有polyhedrin启动子的部分polyhedrin基因。为了构建一个重组转移载体，把上述DNA片段插入一个克隆载体然后将被选择基因插入这个修饰过的克隆载体中，这样它就在polyhedrin启动子的控制下，这个重组转移载体然后与野生棒状病毒DNA混合以产生同源重组并把被选择基因整合入棒状病毒的基因组。棒状病毒Autographa california(Ac MN-PV)和与之相关的polyhedrin启动子被发现对形成能在真核宿主细胞中极高表达被选择基因的病毒表达载体是有用的。专利技术者们建议通过选择产生对某一特定昆虫或多种昆虫有毒性的蛋白的基因并把它克隆于Ac MNPV表达载体上，这种表达载体可以用于控制昆虫的系统。他们建议这种载体可以施用于要保护的植物或动物上。这种重组病毒能在昆虫摄入后入侵肠壁并开始复制。另一种建议是把基因插入棒状病毒的基因组使它与polyhedrin结构顺序相融合，以致当昆虫肠中碱性环境使多角体外壳解离后，有毒物质就被释放出来。更一步的构建杀虫基因并把它们引入需保护靶生物的方法已由Cutler阐述，发表在AG Biotech News vol.7(5)3 17(1990)，题目为《电穿孔用于转化农作物由模式作物证实的成功》。这篇文章指出DNA可以直接用电穿孔进入在萌发的花粉中，花粉可重新放回花中形成种子，然后长成转化植株。这种方法已成功地应用于烟草，可能在玉米和三叶草中也会成功。此方法可能比原生质体电穿孔简单，因为最终目的是授粉并“让花去做这项工作”而不是再生植株。此程序包括收集花粉，让它在萌发液中萌发30-60分钟，之后花粉管将开始伸出花粉粒，在含花粉的悬液中加入需要的DNA，进行电击，在花粉管上打孔，洗去多余的DNA，把变化了的花粉放在植物的柱头上，等待到种子形成。这可能是一种把基因引入作物的简单方法。另一种传递系统由Barnes和Edwards阐明，于1989年8月29日发表在美国专利编号4，861，595中。此专利技术涉及把处理过的、实体上完整的微生物细胞作为传递系统，将蛋白复合物送入动物和人体中。这种微生物细胞先通过一个同源基因产生蛋白到细胞内。再用化学或物理方法处理这种产生蛋白的微生物同时保持细胞结构完整。用这种方法程序操作产生的被处理的微生物体不能繁殖，但胞内复合物的活性没有明显降低。因为这种细胞不能复制，它的稳定的细胞壁可以在需要的动物或人类的消化系统区域里分解，所以此专利技术物可以定时定点地释放被包含的产物。经过合适的处理，这种产生蛋白的微生物细胞本身可以用作传递系统而不需纯化产生的复合物。任何用微生物方法产生的蛋白质、多肽，氨基酸或复合物(包括杀虫剂)都可以作为专利技术的起始材料。Carbonell等人探讨了用DNA技术引入编码蝎毒中神经毒素的人工合成基因的可能性，文章发表在Gene 73409-18(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种自Ｄｉｇｕｅｔｉａ蜘蛛毒液分大量分离的具有有效杀虫活力的多肽或因此在农业上或园艺上可接受的盐。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：卡伦乔安妮克拉肖，布拉德福特卡尔范瓦格纳，约翰伦道夫亨特杰克逊，
申请(专利权)人：FMC有限公司，天然产品科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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