疫苗制造技术

本发明专利技术公开了生产水痘带状疱疹病毒前早蛋白质１７５及其衍生物的方法。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及水痘带状疱疹病毒(VZV)前早蛋白质175和其衍生物以及包括这些蛋白质的疫苗在预防和治疗VZV感染中的应用。水痘带状疱疹病毒(VZV)是人疱疹病毒，它是水痘和带状疱疹的病原体。初期感染或原发感染导致水痘，通常在幼年时感染上，此时为相对良性的。然而，对于幼年时未接触过水痘的成年人，以及被免疫包容的个体有时可以是致命的。同样，VZV感染对于新生儿可以是致命的，因为该病毒能穿越胎盘。人们知道，水痘是极易通过直接接触而传染的疾病。与大多数疱疹病毒一样，VZV趋向于感染某些病毒发育在其中受到抑制的细胞。一段不同的潜伏期之后，水痘带状疱疹(VZ)病毒可被释放，开始感染其它细胞。这种VZ病毒的重新激活每年大约引起5百万例带状疱疹(Plotkin et al.Postgrad.Med.J.61155-63(1985))。带状疱疹特征是大脑神经节和末梢神经发炎并伴有剧痛。目前，重新激活该病毒的因素尚不清楚。现已表明，用VZV减毒品系接种的人从VZV感染获得了保护性免疫力(Arbeter et al.，J.pediatr 100，886-93(1982)and Brunell et al.，Lancet ü1069-72(1982))。这种方法虽是有效的，但由于繁殖水痘带状疱疹病毒有困难而受到限制。在鉴定VZ病毒的抗原成分上人们做了一定的努力。为了开发改良的VZ疫苗特别是亚单位疫苗，分离VZV被膜蛋白是很重要的。Forghani等人(J.Virol.5255-62(1984)).OKuno等人(Virol.129357-68(1983))和Keller等人(J.Virol.52293-7(1984))已从VZV感染的细胞和VZ病毒粒子中鉴定出许多病毒特异性糖蛋白。迄今，人们生产抗VZV的重组亚单位疫苗的努力集中在作为潜在糖蛋白的外被膜糖蛋白上。本专利技术明显不同于这种方法，而是涉及采用VZV的前早非结构蛋白来提供对抗继后之VZV攻击的保护作用。由于胞毒性淋巴细胞CTL的抗原识别机理涉及将天然抗原分解成肽，使蛋白质水解片段结合到MHC分子上并将复合物输送到分子表面，故任何病毒编码的多肽，而不是那些象糖蛋白一样的整合膜蛋白，都可以是T细胞介导的反应的潜在靶体。然而，由于VZV基因组除编码外糖蛋白外，还编码几种非结构蛋白质和内病毒粒子蛋白质，这样就导致有大量的潜在CTL靶体，而不知哪种蛋白质是最相关的。VZV感染的特征是只有极微量的游离病毒存在。在潜伏期和重新激活期间，病毒主要是细胞内的。由此，复发疾病即使是用高水平中和抗体也不能被阻止，而且病毒控制依赖于细胞介导的免疫性。因此，为了用免疫接种法获得保护，人们不仅希望诱导出抗体反应，而且还希望诱导出CTL反应。有效的疫苗应当是只要潜伏病毒重激活信号一出现就能尽早发挥作用的预激态CTL。为了鉴定用于预防或治疗目的之疫苗的最重要的CTL靶抗原，本专利技术人考虑了VZV复制循环。包含病毒基因组之细胞内的病毒蛋白质合成开始时将产生病毒蛋白质片段，该片段由MHC分子呈现于细胞表面上，使其成为适当特异性的CTL的靶。VZV的复制循环持续约24小时并涉及α或前早(IE)β和γ或晚期(L)基因产物的有序表达。因此早期CTL攻击和随后的先于晚结构基因表达的感染细胞的溶胞能阻止新的病毒粒子产生，并由此防止病毒扩散到邻近细胞。为了更为有用，CTL应测检到感染和重新激活后出现在细胞内的最早的病毒蛋白质。IE蛋白质IEP 175是由开放读码设计的ORF62编码的，该蛋白质本身有时称作IE62。该蛋白质作为相对分子量为175 KDa的磷蛋白出现(Kinchinton et al J.of Virology Vol 66(1)(1992)P.359-366))，但推测的分子量为140KDa。它是由人T细胞识别的(Bergen et al Viral.Immunology 4(3)1991 P151))并已提示是为重要的免疫靶体(Bergen et al J.Infectious Diseases(1990)162 P.1049))。有许多系统可供本行业熟练技术人员采用重组DNA技术生产蛋白质，然而，其中大部分已被证实不能成功地生产全长度的IEP175。例如该蛋白在昆虫细胞中被降解。然而，本专利技术人已发现在CHO细胞中表达可生产出天然IEP175的功能等同物和结构等同物(即正确的大小)。因此，在本专利技术的实施方案中提供了无VZV污染物的功能上等同于其天然蛋白质的IEP175。本专利技术还扩展到IEP175的生理功能衍生物。本专利技术的一个方面是提供没有VZV污染物的具有与附附图说明图1中描述的顺序基本上同源之氨基酸顺序的IEP175蛋白质。基本上同源是指本专利技术提供的功能等同物IEP 175蛋白质至少有75%同源于图1中的氨基酸顺序，优选80%，更优选至少90%，且最优选至少95%同源。优选的IEP175衍生物是在大肠杆菌或CHO细胞中表达后得以分泌该蛋白质的那种。特别是提供了其中氨基酸226至257和氨基酸648至733已缺失的可分泌衍生物。典型的其它免疫原衍生物为含有附加顺序的融合多肽。该附加顺序可以携带一或多个抗原决定基，其来自其它VZV蛋白质如VZV糖蛋白，例如gpⅠ，gpⅡ，gpⅢ，gpⅣ或gpⅤ(有时称为gpⅠ，gcⅡ，gcⅢ等)、其它VZV抗原、甚或其它非VZV抗原如乙肝表面或核心抗原。此外，本专利技术的免疫原衍生物可融合于具有免疫刺激特性的载体多肽如佐剂上，或提高对VZV蛋白质的免疫反应，或可用于表达、纯化或配制VZV蛋白质。优选的融合蛋白质包括融合于上述可分泌形式之IEP175的“无锚地”gpⅡ。另一方面，本专利技术提供在调节顺序控制下可表达DNA分子编码的能在异种宿主中发挥功能的IEP 175或其衍生物。特别是提供了基本上同源于附图1中所示DNA顺序的DNA分子。基本上同源是指DNA顺序至于75%同源于图1所示的DNA顺序，优选至少85%，更为优选90%且最优选至少95%。可采用本行业熟知的方法，通过加入、缺失、取代或重排碱基来制备编码IEP175或衍生物的DNA顺序。图1中，开头的ATG编码N末端蛋氨酸，且最后的TGA为转译终止(即停止)信号。本专利技术的再一个方面是提供编码水痘带状疱疹病毒IEP175或衍生物的重组DNA分子或包括DNA顺序的媒体，它可操作地连于在真核宿主细胞中更好是在CHO细胞中起作用的调节区域。本专利技术的另一方面是提供制备水痘带状疱疹病毒IEP175或其衍生物的方法，该方法包括在宿主细胞中表达所述的DNA顺序并回收蛋白质产物。在相关的方面，本专利技术提供了用重组DNA分子转化的重组CHO细胞系。在另一个方面，本专利技术提供了根据本专利技术制备VZV IEP175蛋白质或衍生物的方法，该方法包括在重组宿主细胞中表达编码所述蛋白质或衍生物的DNA顺序并回收所得的蛋白质产物。本专利技术的方法可采用常规重组技术如Maniatis等人在Molecular Cloning-A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor，1982和DNACloning Vol Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ卷(DM，Glover 本文档来自技高网...

【技术保护点】
功能上等同于天然ＶＺＶ ＩＥＰ １７５的无ＶＺＶ污染物的ＶＺＶ ＩＥＰ １７５及其生理学功能衍生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P雅各斯，M马莎尔，M豪蒙特，A波伦，
申请(专利权)人：史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]