一种抗真菌多肽鲎素的遗传工程合成方法技术

一种抗真菌多肽鲎素的遗传工程合成方法包括合成鲎素的基因，构建表达载体和转化受体菌。所合成的鲎素对于发生在水稻、小麦、花生、油菜、黄瓜、辣椒等多种作物上的真菌病害具有防治作用。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
农业生产中的真菌病害危害严重，发病面积广泛，是一种十分难以防治的植物病害。一些真菌病害如水稻稻瘟病、油菜菌核病、马铃薯晚疫病和黄瓜灰霉病等对农作物生产危害极大。在过去的研究中，人们在防治真菌病害方面主要采取了以下几种方法使用化学农药；利用常规育种技术培育抗病品种；通过遗传工程手段将外源抗病基因导入作物使其具有抗病性状；利用微生物来源的产物防治病害。其中由于微生物制剂对环境和人类安全无毒而受到人们的重视。例如，木霉(Trichoderma sp.)和粘帚霉(Gliocladium sp.)产生的胞外壳多糖水解酶和葡聚糖水解酶可用于防治植物病害。其中有些酶已提纯。从T.harzianum P1菌株培养液中提纯的内-壳多糖酶、壳二糖酶、N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷酶和一种葡糖苷酶，以及从绿粘帚霉(G.virens)41菌株培养液中提纯的内壳多糖酶等，都对真菌孢子萌发、细胞复制和菌丝生长有抑制作用。它们对各种真菌的抑制ED50值在32-200μg/ml之间(Lorito，M.et al.，Molecualr Biotechnology，2209，1994)。又如，处理水果和蔬菜的新杀真菌剂包括由季也蒙毕赤酵母、汉森德巴利酵母、酿酒酵母、噬油假丝酵母(Candida oleophila)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、胶红酵母(Rhodotorulla mucilaginosa)、盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosprioides)、灰葡萄孢和指状青霉提取的胞外多糖。这种杀真菌剂对植物病原真菌如指状青霉、扩展青霉、意大利青霉、灰葡萄孢、仁果链核盘菌(Monilinia fructicala)和葡枝霉根(Rhizopus stolonifer)有效。此杀真菌剂是天然的，对人或环境无害。这种杀真菌剂含0.01-1.0％多糖、全酵母细胞、稀释辅料及其它杀真菌剂等(Droby S et al.，1995，Derwent BiotAbstr 1495-07174)。还如，日本专利(平6-133763)报道用枯草芽孢杆菌SD142的培养液或菌体作为杀菌剂。美国EcoScience公司的Stack.J等发现丁香假单孢杆菌的新菌株ATCC55389可用作抑制水果微生物腐败的生物防治剂(WO9515085)。例如用于苹果、柑桔、柠檬、葡萄柚(Derwent BiotechnologyAbstracts，1471，1995)。美国环保局已经批准马里兰州EcoScience Corp的杀真菌剂Bio-Save 10和11在美国上市，Bio-Save用的是从水果表面分离到的微生物，用于防治收获后的水果病害(Biotechnology News vol15.No9.p10.19954.17)。在防治作物的真菌病害方面人们常常使用化学农药，但化学农药的使用已经造成了许多问题(1)生产成本增加生产化学农药需要大量的资金投入，要求的设备复杂、工艺水平先进；(2)加速病菌产生抗药性经多次反复使用化学农药后，自然界中的病菌容易突变产生抗药性，这样人为地给病菌防治造成困难；(3)化学农药施用后在自然界中不易分解，残留的农药造成环境污染的同时还会极大地损害人类的健康；(4)滥用化学农药还会使生态环境遭到破坏、影响生态平衡。同时由于真菌是低等真核生物，其生活史要经历有性世代和无性世代，种类极其复杂而且容易发生变异，因而开发安全有效的新型广谱抗真菌生物制剂显得尤为重要。为此我们在具有高表达能力的生物反应器-酵母中生产这种抗真菌生物制剂，经发酵后上清液可用来制备产品，而酵母经过简单处理可作它用。因此本专利技术的一个目的是在真核生物中生产新型广谱无公害抗真菌生物制剂。通过遗传工程手段、利用生物反应器生产无公害的新型生物制剂是目前国际上研究的热点之一，因为它将为绿色农业革命开辟新的途径。到目前为止，我们还未见到利用酵母表达、生产抗真菌生物制剂的报道，但酵母作为一种良好的真核表达系统已经广泛地成功表达出了许多具有生物活性的物质，这里仅举两例。(1)1994年有人在酵母中获得了具有全部生物学活性的、仅对昆虫具有毒杀作用的昆虫特异性神经毒素蛋白。(Martin-Eanclaire，Marie-France，Morten Sogaard，Cayo Ramos，Sandrien Cestelle，Pierre E.Bongis and BirteSvensson Production of active insect-specific scorpion neurotoxin in yeast1994 European Journal of Biochemistry 223(2)637-645)(2)心钠素是哺乳动物心房组织心肌细胞分泌的一种多肽类激素，具有很强的利钠、利尿和扩张血管、降低血压等作用，可调节体内的水盐平衡，对于治疗高血压、心肾功能不全等疾病具有很重要的作用。有人在酵母中表达分泌了人心钠素。(秦宁，魏楠，姚锡惠，李育阳 人心钠素在酵母细胞中的合成与分泌1991中国科学(B)162-66)鲎素(tachyplesin)是在分析海洋生物-鲎(horseshoe crab.Tachypleus ridentatis)中的各种生物活性物质时发现的存在于血淋巴细胞中体积较小、密度较高的颗粒中的一类17氨基酸的多肽，具有抵抗外源病原体入侵的能力。这些生物活性物质包括凝集素、凝血因子、蛋白酶抑制剂及其它一些抗菌肽。鲎素不但可以抑制革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的生长，而且对真菌的生长也具有强烈的抑制作用(Shigenaga，T.et al.，1992，Joumal of BiologicalChemistry，26521350-21354)。在欧洲专利(Application number923110993，Publicationnumber0 545 730 A1)中介绍，从鲎中提取的天然鲎素多肽对几种植物病原真菌都有很强的抑制作用，这些真菌包括Fusarium graminearum，Aspergillusflavus，Sclerotinia trifoliorum。由于该专利也曾提出可用遗传工程方法合成鲎素的设想，但无具体技术方案。鲎素由17个氨基酸残基组成，肽链内的第十位的甘氨酸非常保守，而且羧基端具有一个独特的精氨酸-酰胺结构。由于肽链内两个二硫键的存在使得其在低pH值和高温下结构保持稳定。鲎素碱性很强，并且具有三个四肽组成的串联重复结构，即疏水氨基酸-半胱氧酸-疏水氨基酸(芳香族)-精氨酸，这种结构与发夹结构一起决定了此肽的双亲性，而这种双亲性可能与其抗菌活性有关，这个肽的阳离子“尾部”能与细菌脂多糖及膜上的酸性磷酸脂相互作用，而疏水性头部可破坏脂双分子层，这种膜系统的紊乱可能是病原微生物失去活性的主要原因(Nakamura，T.et al.，1988，Journal ofBiological Chemistry，26316709-16713)。鲎素的前提结构已经清楚。鲎素前体具有一个23氨基酸残基的presegment，其后为17个氨基酸的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗真菌多肽鲎素的遗传工程合成方法，其特征在于包括下述步骤：ａ．合成鲎素的基因。ｂ．构建表达载体。ｃ．转化受体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张春义，范云六，赵军，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]