重组腺伴随病毒定向基因治疗的方法技术

重组腺伴随病毒ｒＡＡＶ在生产用于减少对ｒＡＡＶ免疫应答的药物中的应用，该重组腺伴随病毒包含异源基因，该异源基因与控制其在细胞内表达的序列操作性连接，其中ｒＡＡＶ基本上不受辅助病毒的污染，并将其给予骨骼肌细胞。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本项工作得到国家健康协会授予的DK47757号基金的支持。美国政府享有本专利技术部分权利。
技术介绍
腺伴随病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其基因组长约4.6kb，包括145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。AAV的单链DNA基因组含有复制和形成毒粒的基因(rep和cap)。当该非病原性人病毒感染人细胞后，病毒基因组整合入染色体19中，导致细胞潜伏感染，不产生感染的病毒，也不复制，除非细胞同时被裂解性辅助病毒(如腺病毒或疱疹病毒)共感染。在被辅助病毒感染后，AAV原病毒得到挽救并被扩增，从而产生了AAV和辅助病毒。AAV具有独特的特征，即它可作为有吸引力的载体用来将外源DNA传递到细胞中。许多实验小组已经研究了AAV在治疗疾病中的潜在应用。重组AAV(rAAV)的体外研究是令人失望的，因为其转导频率很低；在没有污染性的野生型AAV或辅助腺病毒存在下使细胞与rAAV一起培育只伴随很少的重组基因表达。而且，当rep不存在时，整合的效果很低，并且不能定位于染色体19。当腺病毒存在时，AAV的转导显著增强，因为单链rAAV基因组被转变成具有转录活性的非整合的、双链中间产物。腺病毒通过早期基因产物E4 ORF6的表达增强了rAAV的转导。现已在基因治疗体内模型中混入了rAAV起载体功能。最有希望的结果是在中枢神经系统中，在该处的减数分裂后的细胞中实现了稳定的转导。骨髓细胞与rAAV活体外培育会产生一些转导，尽管在移植模型中没有证明有稳定而有效的造血移入。对气道或血液给予rAAV会使基因分别转入肺上皮细胞和肝细胞中；然而，发现转基因表达水平很低，除非有腺病毒存在。所需的是改善rAAV-介导的转基因方法。专利技术概述本专利技术提供了一种改善所选基因(该基因通过重组AAV传递给动物)表达的方法。方法包括在没有辅助病毒存在下，将包含所需转基因的重组AAV载体导入肌细胞中。该载体可给予心肌、平滑肌或最好是骨骼肌。在一个较佳的实例中，rAAV传递的转基因编码一种在治疗上有用的可分泌和/或可扩散的产物。在该实例中，转基因产物对距递送部位一定距离的部位有治疗效果。在另一个实例中，转基因编码了需要传递给肌肉(例如用来治疗肌肉营养不良)的不可分泌的产物(如肌营养不良蛋白多肽)。本专利技术另一方面提供了一种治疗动物血友病的方法。方法包括对动物肌肉给予重组的腺伴随病毒，该病毒包含编码因子Ⅸ的基因和调节该基因表达的序列。本专利技术还有一个方面提供了治疗动物动脉粥样硬化的方法。该方法包括给予动物肌肉重组的腺伴随病毒，该病毒包含编码ApoE的基因和能表达所述基因的调控序列。在本专利技术较佳实例的详细描述中将进一步说明本专利技术的其它方面与优点。附图简述附图说明图1示出了AAV.CMVLacZ(4883bp)的线型排列结构。相关元件包括AAVITR(实心黑框)、CMV启动子(带阴影线的箭头)、SV40内含子和聚腺苷酸化信号(空心框)和lacZ DNA(带点方框)。另外还示出了用来检测内部BamHⅠ片段和全长载体的cDNA探针的位置。图2A示出了AAV.CNVLacZ串联体(concatomer)的线型排列。相关的标记包括AAV ITR(带阴影线的方框)、CMV增强子/启动子(实心黑色箭头)、SV40内含子和聚腺苷酸化信号(空心方框)和lacZ cDNA(带点方框)。图中示出的AAV.CMVLacZ单体是在ITR处(标记j处)按直接末端对末端的方式连接的。因此，在草图中，在接头处有两个拷贝的AAV ITR。图2B示出了连接区域的放大视图。相关标记的说明在上述图3A中。水平箭头表示用来扩增横跨原病毒接头的PCR引物的位置和方向。引物005是有义链引物。引物013和017是反义链引物。图3示出了采用直接末端对末端串联连接的单体AAV.CMVLacZ基因组后预计的PCR产物。接头处(标记J处)示出了两个完整的ITR(有阴影线的方框)及其各自的“FLOP”和“FLIP”取向。另外还示出了CMV启动子(实心黑框)和聚腺苷酸化信号(空心方框)。pCRⅡ中PCR克隆部位侧接EcoRⅠ位点(如图所示)。图中还示出了位于PCR产物中的三个SnaBⅠ位点。还示出了引物005和013。图4A与图4B-4G一起描述了PCR产物的结构，该结构是如图4A所示的的头接尾的AAV.CMVLacZ串联体。图4A显示了采用直接末端对末端串联连接的单体AAV.CMVLacZ基因组的预计PCR产物。接头处(标记j处)示出了两个完整的ITR(有阴影的方框)及其各自的“FLOP”和“FLIP”取向。另外还示出了CMV启动子(实心黑框)和聚腺苷酸化信号(空心方框)。图4B表示克隆3的PCR产物的结构。图4C表示克隆8的PCR产物的结构。克隆8的大小与克隆3几乎相等，但有不同的ITR接头排列方式。图4D表示克隆5的PCR产物的结构。图4E表示克隆2的PCR产物的结构。图4F表示克隆6的PCR产物的结构。图4G表示克隆7的PCR产物的结构。图5A表示针对腺病毒抗原和lacZ的细胞毒性T淋巴细胞的激活。这是对从实施例5组1收获的淋巴细胞进行的分析。图5B表示针对腺病毒抗原和lacZ的细胞毒性T淋巴细胞的激活。这是对从实施例5组2收获的淋巴细胞进行的分析。图5C表示针对腺病毒抗原和lacZ的细胞毒性T淋巴细胞的激活。这是对从实施例5组3收获的淋巴细胞进行的分析。图6A表示实施例5组1-4中在对包括β-半乳糖苷酶、纯化AAV或腺病毒不同抗原应答反应中T淋巴细胞的激活情况。通过代表T细胞TH1亚组的IFN-γ的分泌来证明此种激活。图6B表示实施例5组1-4T淋巴细胞在对包括β-半乳糖苷酶、纯化AAV或腺病毒的不同抗原的应答反应中的激活情况。通过表示T细胞TH2亚组的IL-10的分泌来证明此种激活。图7A表示酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果，其显示了实施例5各组中抗β-半乳糖苷酶的抗体的发生。图7B表示酶联免疫吸附测定(ELISA)的结果，其显示了实施例5各组中抗5型腺病毒的抗体的发生。图8是在每个动物(n=4)中IM注射2×1011rAAV-hF.Ⅸ载体基因组后，C57BL/6小鼠中的hF.Ⅸ血浆浓度随时间变化的示意图。图9表示给C57BL/6小鼠中IM注射rAAV-hF.Ⅸ后产生的抗入F.Ⅸ的循环抗体。用ELISA，以小鼠MAb抗hF.Ⅸ作为标准品，测定在每个动物中注射2×1011载体基因组(n=3)后血浆中抗hF.Ⅸ抗体浓度随时间变化情况。每条线代表一只动物。图10表示三只小鼠的hF.Ⅸ血浆浓度随注射后时间的变化情况。每种记号表示不同的动物。本实验中第四只动物在注射后5周时进行创伤性放血后死亡。图11表示四只Rag-1小鼠的hF.Ⅸ血浆浓度随注射rAAV-hF.Ⅸ后时间的变化情况。每个标记代表不同的动物。图12表示转导细胞中的rAAV头对尾串联体示意图。图13表示AV.CMVApoE的构建过程。专利技术详述本专利技术提供了一种腺伴随病毒介导的定向于肌肉的转基因方法，该方法可在没有辅助病毒或外源辅助分子存在下，高水平地、稳定地表达转基因。该方法特别涉及将携带所需转基因的重组AAV导入肌细胞。将rAAV载体按照希望的那样直接注射入心肌、骨骼肌或平滑肌中，而转基因则编码分泌的和/或可扩散的治疗产物(如多肽或RNA分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·威尔逊，K·J·费希尔，
申请(专利权)人：宾西法尼亚大学托管会，
类型：发明
国别省市：