保存原核细胞的方法和由此获得的组合物技术

本发明专利技术提供干燥和稳定原核细胞的方法，及由此获得的组合物。首先在足以诱导细胞内海藻糖的条件下培养或温育细胞，将其悬浮于稳定液中并干燥，形成一种固态玻璃。所得产物在室温下有贮存稳定性，贮存后几乎不丧失生存力。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及保存细胞的领域。更具体而言，它涉及干燥和稳定原核细胞的方法，及由此获得地组合物。
技术介绍
活原核细胞，尤其是细菌，已被日益广泛地用于重要的医学、农业和工业应用。农业或环境应用包括生物杀虫剂和生物除污。医学应用包括活细菌在疫苗中的应用，以及用于药物产品或许多工业组合物的产生。活菌疫苗的应用增多，使生物工程学以及对传染病治疗的集中研究在过去的二十年中显著增长。当根据希望的结果和费用来保存其能被有效使用的生存力时，细菌细胞必须能被贮存一段特定时间。已证实贮存生存力是一个主要的困难。保存活原核细胞的方法具有几个严重的缺点，例如是耗费能量的并且需要冷藏。此外，现有的保存方法不能提供令人满意的经贮存后的生存力，特别是当细胞贮存于环境温度或更高的温度时。冷冻干燥通常用于原核细胞的保存和贮存。然而，它具有所不希望的特性，如显著降低生存力以及费时、耗费能源，因此是昂贵的。冷冻干燥包括将细胞置于溶液中，冷冻该溶液，并在一定条件下将冷冻的固体暴露于真空，在该条件下通过升华作用去除水和其它任何挥发性的成分而保留固体。产生的干燥制剂包含原核细胞。尽管冷冻干燥十分普遍，但冷冻干燥的细菌在环境温度下是不稳定的，因此需要通过冷藏来贮存。然而，即使冷藏时细胞也能快速丧失生存力。可以通过赋形剂如冷冻保护剂的使用，使该方法引起的损害降低至一定程度。然而，冷冻保护剂随后可与干燥的细胞反应，影响冷冻干燥的原核细胞在贮存中固有的不稳定性。用于制备干燥的、据称稳定的原核细胞制剂的其它方法如环境温度干燥、喷雾干燥、液体制剂以及含冷冻保护剂的细菌培养物的冷冻也有缺点。关于原核生物的干燥耐受性的综述，见Potts(1994)微生物学综述(Micro.Rev.)58755-805。环境温度干燥技术去除了冷冻步骤及与冷冻相关的对物质的损伤，这些技术在水的去除方面更加快速和节约能源。Crowe等人(1990)低温生物学(Cryobiol.)27219-231。然而，环境温度干燥通常不能产生令人满意的生存力。喷雾干燥法造成有限的贮存时间和生存力的降低，甚至当使用稳定的赋形剂时也如此。综述见Lievense和van’t Reit(1994)生化工程学/生物工程学进展(Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.)5145-63；72-89。液体制剂仅可提供短期的稳定并且需要冷藏。冷冻的细菌培养物导致对细菌细胞壁的实质性损伤和生存力的损失，通过冷冻保护剂的使用仅仅可以缓解但不消除这种后果。而且，这些冷冻的培养物也需要冷藏贮存。海藻糖(α-D-葡吡喃糖基-α-D-葡吡喃糖苷)是天然发生的、非还原二糖，最初发现它在特定的植物和动物中与脱水的防止有关，这些植物和动物能不被损伤地干燥，并能在再水合时复苏。已显示海藻糖可用于防止脱水过程中蛋白质、病毒和食品的变性。见美国专利号4,891,319；5,149,653；5,026,566；Blakeley等人(1990)柳叶刀(Lancet)336854-855；Roser(1991年7月)食品科学和技术趋势(Trends in Food Sci.andTech.)10166-169；Colaco等人(1992)国际生物工程学(Biotechnol.Internat.)1345-350；Roser(1991)生物药物学(BioPharm.)447-53；Colaco等人(1992)生物/技术(Bio/Tech)101007-1011；以及Roser等人(1993年5月)新科学家(New Scientist)25-28页。海藻糖二水合物是可商业获得的优质生产规范(GMP)级的结晶制剂。EP专利公开文本639645A1中描述了一种从淀粉中制备海藻糖的方法。该方法包括两个步骤，淀粉的酶生物转化产生海藻糖糖浆，通过结晶作用从糖浆中回收糖。细菌能够通过积累和/或合成钾及少数类型的有机分子(包括某些糖)来对抗渗透压休克。在不含任何渗透保护化合物的葡萄糖-无机物培养基中，细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)的渗透调节包括海藻糖的内源产生。Larsen等人(1987)微生物学档案(Arch.Microbiol.)1471-7；Dinnbier等人(1988)微生物学档案150348-357；Giaever等人(1988)细菌学杂志(J.Bacteriol.)1702841-2849；以及Welsh等人(1991)普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)137745-750。保存原核细胞的一种方法是在海藻糖的存在下冷冻干燥。见例如，Israeli等人(1993)低温生物学30519-523。然而，该方法不能提供令人满意的生存力。Israeli等人在100mM海藻糖的存在下冷冻干燥大肠杆菌，但仅报道了干燥样品在21℃下暴露于空气后4天的存活数据。以后的研究检测了在海藻糖存在下冷冻干燥的大肠杆菌和Bacillusfluoringiensis的存活率。Leslie等人(1995)应用环境微生物学(Appl.Env.Microbiol.)613592-3597。仅报道干燥样品暴露于空气后4天的存活数据。在海藻糖存在下将冷冻干燥的大肠杆菌与空气干燥(在氮气中密封)的大肠杆菌相对比的另一个研究报道，贮存25周的细胞其存活率为每毫升大约107到超过1010菌落形成单位(CFU)，但细胞贮存于4℃。Louis等人(1994)应用微生物学和生物工程学(Appl.Microbiol.Biotechnol.)41684-688。由于活细菌应用的增加和现有的关于在贮存期间保持细菌生存力的问题，所以迫切需要廉价地干燥和稳定原核细胞的方法。特别希望的是发展允许将干燥的原核细胞贮存于环境温度下、即不需要冷藏的方法。在此描述的方法通过提供干燥的、显著的贮存稳定性的原核细胞以满足这种需要，这些细胞保留生存力而不需要冷藏。在此引用的所有参考文献由此全部引入作为参考。 专利技术概述本专利技术包括产生干燥的、稳定的原核细胞的方法。本专利技术也包括通过这些方法产生的组合物，以及重建这些原核细胞的方法。因此，一方面，本专利技术提供保存原核细胞的方法，包括在将细胞内海藻糖浓度提高至对提高贮存稳定性有效的量的条件下培养原核细胞，将原核细胞与包含一种稳定剂如海藻糖的干燥液相混合，以及干燥原核细胞以产生具有低于约5％的残余湿度的一种玻璃(glass)。 附图简述附图说明图1显示由多种生物的基因所编码的海藻糖合成酶氨基酸序列的比较1.乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyceslactis)；2.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；3.黑曲霉(Aspergillus niger)；4.粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；5.麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)和6.大肠杆菌(分别为SEQ ID NOS1-6)。图2是检测海藻糖合成酶基因在大肠杆菌和沙门氏菌(Salmonella)中存在的Southern印迹的中等程度显色。左侧的水平线分别代表23、9.3、6.6、4.4、2.3、2.0和0.56kb的分子量标准参照物(λHindIII)。图3是描述在37℃贮存后大肠杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种保存原核细胞的方法，它包括以下步骤：ａ）将原核细胞的细胞内海藻糖浓度提高至对提高贮存稳定性有效的量；ｂ）将步骤ａ）中获得的原核细胞与一种包含稳定剂的干燥液相混合；以及ｃ）在一定条件下干燥步骤ｂ）的产物，该条件足以产生具有低于 约５％残余湿度的玻璃形式的稳定剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：AG图纳克里夫，DT威尔史，BJ罗瑟，KS德哈利瓦尔，C克拉克，
申请(专利权)人：扇形支撑剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]