黑皮素制造技术

本发明专利技术提供了衍生自包括ＡＣＴＨ在内的一组激素中的一些新型肽。这些命名为黑皮素的肽可以靶向在数种组织中分布常各异的不同受体。本发明专利技术的肽可用于以激动剂方式靶向神经系统中的受体。也公开了一些药物组合物以及它们的用途。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及黑皮素(melanocortin)肽领域。黑皮素(过去也称为促黑激素)是最初来源于命名为阿黑皮原(pro-opiomelanocortin)这样一种较大前体蛋白的肽类。天然黑皮素都具有七肽核心序列Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。这些黑皮素包括α-MSH(α-促黑激素)，β-MSH，γ-MSH，γ-LPH(γ-促脂解素)和ACTH(促肾上腺皮质激素)。黑皮素有广泛的生物学活性，很早就知道它们能够刺激色素形成及皮质类固醇的形成，同时也发现它们能够诱导大鼠的过量梳理行为，促进可控的行为规避反应，升高血压及加快心率，加速神经重建和调节免疫反应。就在最近，鉴定和克隆了黑皮素的5种神经肽受体。这些受体在不同的组织类型中具有不同的分布形式(在空间上以及丰度上)。它们属于所谓的G-蛋白偶联受体家族。黑皮素受体1(MCR-1)在黑色素细胞中表达，然而MCR-2是在诸如肾上腺中表达的促肾上腺皮质激素受体。已经发现黑皮素受体3、4和5表达于中枢神经系统。与这些受体相关的配体具有极大的神经药理学作用，例如使唤起、运动、注意力、记忆和学习变得容易。这些配体也与食物激发的行为有关。此外还发现它们与解热活性有关。已制备了许多不同的(合成的)黑皮素类似物，并建议用于激活或阻抑一种或多种黑皮素受体。已揭示这种激动性或拮抗性作用可用于涉及色素形成、神经重建等方面的应用中。然而，迄今为止研究的黑皮素均缺乏对神经系统所表达受体的专一性(选择性)，和/或缺乏足够的结合亲和性或诱导受体介导之反应或阻碍所述反应的能力。通常期望一种靶向MC-受体的药物能够高度有效、可以口服、能适度抵抗体内的降解(具有足够的半衰期)并能够通过血脑屏障。本专利技术提供了符合这些结构要求、基本上可用作MC受体特异性药物的肽或肽样结构。这样，本专利技术提供了对黑皮素受体，尤其是对mc3、mc4或mc5受体具有特异性结合亲和力的肽，其包含下列序列X-Y-His-(D-2-噻吩基-Ala)-Arg-(Z)或X-Y-His-(3-吡啶基-D-Ala)-Arg-(Z)其中，X和Y是氨基酸残基，Z是一个芳香族氨基酸残基。根据本专利技术，上述肽是高度有效的MSH活性激动剂。达到这种高效力的原因可归因于第7位(按原始ACTH分子的位置计)，这一位置应是D-2-噻吩基-Ala或3-吡啶基-D-Ala，并且对该位置，只能替换成非常有限和非常相似的残基才不至于影响激动剂效力的提高。MSH激动剂活性的另一重要原因是残基1-3和/或残基11-13的去除。第9位芳香族氨基酸的存在也对活性贡献很大。第4和5位正常情况下不可以去除；这些残基应该存在，尽管在所述位置存在哪种氨基酸残基远不那么关键。已经清楚，在这些位置至少可以允许进行保守的替换，并且不太保守的替换一般也不会导致效力的显著丧失。第6位的组氨酸残基和第8位的精氨酸残基对活性非常重要，如果能够进行替换的话，那也只能进行保守的替换。特别是，在同一分子内，更重要的残基一般不应该全部被替换。第9位的优选残基是Naftyl-alanine，既可以是D构象，也可以是L构象。这个残基的存在导致效力进一步提高。第10位氨基酸残基对该分子的活性不是必需的，但它确实有一些影响。如果存在残基的话，那么优选的是甘氨酸或赖氨酸，其中后者有另外的优点，即可以提供反应活性部分，所述部分可以用于将该肽与其它分子偶联或使该肽环化。如果要形成环形肽(这比较优选，因为这种环形肽的半衰期比线性形式有了提高)，那么在另一端也应该提供反应活性部分。环形肽另一个优点是它们倾向于对MC受体有更高的选择性，特别是二硫桥可提高对MC-4受体的选择性。然而，也可以通过在基本核心之外提供可使环闭合的反应活性部分(例如导致形成内酰胺的反应活性部分)而产生环形肽。在位置X和Y(指在原始ACTH核心中第4和5位)最理想的残基，X位置是Nle，Y位置是甘氨酸或天冬氨酸，其中天冬氨酸的存在还有其它优点，即具有产生内酰胺的反应活性部分。本专利技术的肽一般比MSH本身更有效。优选肽的效力比MSH要高达100倍。本专利技术也包括一些效力较低的肽，因为效力并不是以肽为基础的有效药物必须符合的唯一标准。如上面已经提到，半衰期和选择性也是重要参数。确定肽效力的试验是常规的体外试验，以及在大鼠中衡量梳理行为的体内实验。梳理实验的结果很好地显示出诸肽能够激活受体，并且由此激活与所述受体偶联的G蛋白级联，因此，这些肽能够用作MC受体的激动剂。本专利技术提供了对MC受体特别具有选择性的肽，以激动剂的方式靶向MC受体、特别是MC-4受体可以用于治疗中枢神经系统失调，各种神经病，肥胖症，特别是与神经病有关的糖尿病，以及由细胞毒性治疗(化学治疗法等)引起的神经病。因此，本专利技术也提供了能够治疗上述病情的药物组合物。用于这种治疗的剂量通常是每日给药一次，用量为每剂量单位约1μg-100mg，优选10μg-10mg，更优选50μg-1mg。该剂量应能使得体内浓度可达0.1nM-1μM，优选1nM-100nM，更优选10-50nM。组合物中可含有用于肽药物或肽衍生药物常规剂型的常规添加剂。这种剂型优选是口服剂型，如片剂、粒剂、粉剂或液体剂型，虽然也可以应用肠内和胃肠外施用方式。特别优选的是这样的组合物，其中本专利技术的肽与旨在预防或可导致神经病的药物(如胰岛素和细胞毒性剂)一起合并使用。本专利技术将在下面的试验部分作详细解释。实验材料与方法黑皮素配体的受体活性通过磷酸钙沉淀方法，用人MC3(Gantz等，JBC 1993.2688246-8250)、人MC4(Gantz等JBC 1993.26815174015179)或人MC5受体构建体稳定地转染了人胚肾(HEK293)细胞。在每一个实验的开始时，用pCRE-LacZ载体10μg(Chen等，1995，生化分析226349-354)进行转染，充当报告质粒，该载体中LacZ基因的表达由一个cAMP响应性元件驱动。在pCRE-LacZ转化后第二天，将细胞分离到96孔板上。48小时后，用测试培养基(DMEM+0.1mg/ml BSA，0.1mM IBMX)中的不同浓度MC受体配体刺激细胞6小时。在裂解缓冲液中经一轮冻融裂解细胞，加入底物缓冲液(60mM磷酸钠，1mM氯化镁，5mM β-巯基乙醇，200μg/ml ONPG)，然后将细胞在37℃培养1小时。利用如Chen等所述的显色测定法，在小平板读数仪(Biorad Model 3500)中，于405nm检测因受体激活所引起的cAMP信号转导通路激活情况。动物，插管植入，脑室内注射在深度麻醉状态下，将插管植入体重为120-130g的雄Wistar大鼠的脑室内孔中(Brakkee等，生命科学，第17卷，1979)。使大鼠恢复3天，再用于接下来的10天实验中。如果大鼠被用于多次梳理实验中，那么它们应在连续的实验之间恢复至少三天。用Hamilton注射器，对溶于3μg盐溶液(154mM氯化钠)中的肽(15ng)进行脑室内注射。按照Gispen等(实验动物科学(Lab.Anim.Sci.)，29，1975)的方法进行梳理实验。注射后立即将大鼠置于观察盒内。在注射15分钟后开始观察，并持续50分钟。在50分钟的时间内，每15秒对梳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对黑皮素受体、优选ＭＣ３或ＭＣ４或ＭＣ５受体具有特异结合亲和性的肽，其包括序列Ｘ－Ｙ－Ｈｉｓ－（Ｄ－２－噻吩基－Ａｌａ）－Ａｒｇ－（Ｚ）或Ｘ－Ｙ－Ｈｉｓ－（３－吡啶基－Ｄ－Ａｌａ）－Ａｒｇ－（Ｚ）其中Ｘ和Ｙ是氨基酸残基， 且Ｚ是一个芳族氨基酸残基。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：RAH阿丹，JPH布巴奇，WH吉斯佩，
申请(专利权)人：扇形支撑剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]