一种具有pH响应性的多西环素控释季铵盐壳聚糖‑脂质体复合纳米粒及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种具有pH响应性的多西环素控释季铵盐壳聚糖‑脂质体复合纳米粒及其制备方法。本发明专利技术以壳聚糖、卵磷脂、多西环素、碘甲烷等为原料，通过薄膜分散法，正负电荷吸附法制备得到的pH响应多西环素控释季铵盐壳聚糖‑脂质体复合纳米粒能够通过电荷作用吸附在菌膜表面，当复合纳米粒处于菌膜独特的低pH环境时，季铵盐壳聚糖中未进行季铵化反应的游离氨基发生质子化反应，从而使纳米粒外壳携带更多的正电荷，破坏原有季铵盐壳聚糖‑脂质体纳米粒稳定性，促进多西环素在菌膜处的释放，最终达到破坏菌膜，杀死病菌的作用。本发明专利技术提高了多西环素的递药效率和药效，在医药、医用材料等许多方面具有良好的研究和开发应用前景。

A pH response of the doxycycline controlled release of chitosan quaternary ammonium liposome composite nanoparticles and preparation method thereof

【技术实现步骤摘要】
一种具有pH响应性的多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒及其制备方法
本专利技术属于生物医疗领域，具体涉及一种具有pH响应性的多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒及其制备方法。
技术介绍
细菌生物膜是一种包裹于细胞外多聚物基质中不可逆的黏附于非生物或生物表面的微生物细胞菌落。细菌通过自身合成的水合多聚物粘附在固体表面,以固着的方式生长从而形成生物膜，细菌生物膜的形成涉及到几个明显的阶段，包括起始的附着、细胞与细胞之间的吸附与增殖、生物膜的成熟及最后细菌的脱离等四个阶段。有文献报道，几乎所有的细菌在一定的条件下都可以形成生物膜。生物膜结构非常复杂，除了不同种类的细菌外，还有细菌分泌的各种胞外多糖，,胞外蛋白质等。生物膜的形成增加了细菌对抗生素的抗性以及帮助细菌逃逸寄主的免疫攻击，且感染部位难以彻底清除，还可诱导耐药性产生，从而使得生物膜在临床更易引发难治性持续性的慢性感染，严重威胁人类健康。菌膜微环境具有独特的特征，其pH可以达到5.0，甚至更低，此外菌膜表面带有大量的负电荷，因此，设计一种靶向性的能够吸附在菌膜表面并且对菌膜的低pH环境有响应性的纳米粒子是破坏菌膜，杀死菌膜内菌体的有效方式。壳聚糖是天然的阳离子多糖，具有安全无毒、生物可降解的特点。将壳聚糖进行季铵化修饰能明显增强其水溶性和抑菌性，并能够携带永久正电荷。脂质体是一种带负电囊泡状结构的生物材料，被广泛应用于药物输送载体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种具有pH响应性的多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒及其制备方法。本专利技术以壳聚糖、卵磷脂、多西环素、碘甲烷等为原料，通过薄膜分散法，正负电荷吸附法制备的pH响应多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒能够通过电荷作用吸附在菌膜表面，并且在菌膜酸性环境中加速纳米粒裂解，促进多西环素的释放，最终达到破坏菌膜，杀死病菌的作用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种具有pH响应性的多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒的制备方法，它包括以下步骤：（1）称取壳聚糖粉末，加入NaOH溶液，室温溶胀；再加入二甲基亚砜和碘甲烷，55-65℃反应1-2h，反应后继续分别加入NaOH和碘甲烷，继续反应1h，反应结束后；加入无水乙醇出现白色沉淀终止反应，透析，冻干即得水溶性的季铵盐壳聚糖；（2）称取蛋黄卵磷脂，加入三氯甲烷和无水乙醇溶解，30-40℃水浴加热处理1-2h；再加入溶有胆酸钠和多西环素的PBS缓冲液，在50-60℃水浴中旋转搅拌，超声后得到包载多西环素的脂质体纳米粒混悬液；（3）配制所述季铵盐壳聚糖溶液，缓慢滴加到包载多西环素的脂质体纳米粒混悬液中，边滴加边搅拌，所述季铵盐壳聚糖溶液与脂质体纳米粒混悬液的体积比为1:1-5:1，室温下搅拌，超声后得到多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒。进一步的：所述步骤（1）中壳聚糖粉末的分子量为15-150kDa。进一步的：所述步骤（1）中壳聚糖粉末与NaOH溶液的质量体积比为1000:3-1000:5。进一步的：所述步骤（1）中季铵盐壳聚糖的取代度为65%-80%。进一步的：所述步骤（1）中壳聚糖粉末与二甲基亚砜的质量体积比为50:1-100:1，壳聚糖粉末和碘甲烷的质量体积比是1000:3-1000:6。进一步的：所述步骤（2）中所述蛋黄卵磷脂的质量、三氯甲烷体积和无水乙醇体积的质量体积比为10:1:1-20:1:1。进一步的：所述步骤（2）中胆酸钠和多西环素的质量比为5:1。进一步的：所述步骤（3）中所述季铵盐壳聚糖溶液的浓度为0.5mg/mL-2mg/mL。本专利技术还提供了所述的制备方法制得的多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒。所述复合纳米粒的平均粒径在155-197nm，Zeta电位为-13—-19mV，多西环素包封率为45%-65%。与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术中通过壳聚糖与碘甲烷反应制得季铵盐壳聚糖，使用的壳聚糖分子量为15-150kDa，脱乙酰度大于90%。得到的季铵盐壳聚糖取代度为65%以上。将所得产物进行粒径和电位分析，结果表明，所制备的pH响应多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒粒径分布较窄，平均粒径在155-197nm，Zeta电位为-13—-19mV。多西环素包封率为45%—65%。本专利技术具有操作简单、制备技术工艺简便以及制造成本低廉等优点。可以通过改变投料比调整纳米粒粒径以及电位。所形成的pH响应性多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒呈规则球形。本专利技术的重要意义在于形成的pH响应性多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒具有菌膜靶向性，在菌膜酸性环境中加速纳米粒裂解，促进多西环素的释放，最终达到破坏菌膜，杀死病菌的作用，具有良好的开发应用潜力。本专利技术以带负电荷脂质体作为包载多西环素的核心载体，然后使用碘甲烷对壳聚糖进行季铵化修饰，得到的正电性季铵盐壳聚糖作为纳米粒外壳。通过正负电荷吸附制备了多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒。当复合纳米粒通过电荷作用粘附在菌膜上，处于菌膜独特的低pH环境时，季铵盐壳聚糖中未进行季铵化反应的游离氨基发生质子化反应，从而使纳米粒外壳携带更多的正电荷，破坏原有季铵盐壳聚糖-脂质体纳米粒稳定性，导致多西环素在菌膜病灶处迅速释放，达到破坏菌膜，杀死病原菌的目的。该产品能够提高纳米粒对菌膜的粘附性，促进药物在菌膜处的累积释放，能有效的破坏菌膜，具有十分重要的理论意义和临床应用价值。附图说明图1是所述的具有pH响应性的多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒透射电子显微镜图。具体实施方式本专利技术结合附图和具体实施例对pH响应性多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒做出进一步说明。本专利技术以壳聚糖、卵磷脂、多西环素、碘甲烷等为原料，通过薄膜分散法，正负电荷吸附法等方法合成目标产物，即pH响应性多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒。具体步骤如下：1、季铵盐壳聚糖制备：称取分子量为15-150kDa壳聚糖粉末，加入15%（m/v）NaOH，在平底烧瓶室温溶胀10min-20min，壳聚糖粉末与NaOH溶液的质量体积比为1000:3-1000:5（本专利技术中质量体积比的质量单位为mg，体积的单位为mL）；再加入二甲基亚砜和碘甲烷，壳聚糖粉末与二甲基亚砜的质量体积比为50:1-100:1，壳聚糖粉末和碘甲烷的质量体积比是1000:3-1000:6，60℃反应1h。反应后继续加入NaOH和碘甲烷，继续反应1h。反应结束后，加入无水乙醇出现白色沉淀终止反应，透析三天，冻干。即得水溶性的取代度为65%-80%的季铵盐壳聚糖。2、脂质体的制备：称取蛋黄卵磷脂（SPC），加入三氯甲烷和无水乙醇溶解，所述蛋黄卵磷脂的质量、三氯甲烷体积和无水乙醇体积的质量体积比为10:1:1-20:1:1。35℃水浴加热处理1h，使得卵磷脂在烧瓶内壁形成一层均匀薄膜。再加入溶有质量比为5:1的胆酸钠和多西环素的pH7.4PBS缓冲液，在55℃水浴中旋转搅拌30min，超声后得到包载多西环素的脂质体纳米粒混悬液。3、pH响应性的多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒制备：配制0.5mg/mL-2mg/mL所述季铵盐壳聚糖溶液，缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有pH响应性的多西环素控释季铵盐壳聚糖‑脂质体复合纳米粒的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）称取壳聚糖粉末，加入NaOH溶液，室温溶胀；再加入二甲基亚砜和碘甲烷，55‑65℃反应1‑2 h，反应后继续分别加入NaOH和碘甲烷，继续反应1 h，反应结束后；加入无水乙醇出现白色沉淀终止反应，透析，冻干即得水溶性的季铵盐壳聚糖；（2）称取蛋黄卵磷脂，加入三氯甲烷和无水乙醇溶解，30‑40℃水浴加热处理1‑2 h；再加入溶有胆酸钠和多西环素的PBS缓冲液，在50‑60℃水浴中旋转搅拌，超声后得到包载多西环素的脂质体纳米粒混悬液；（3）配制所述季铵盐壳聚糖溶液，缓慢滴加到包载多西环素的脂质体纳米粒混悬液中，边滴加边搅拌，所述季铵盐壳聚糖溶液与脂质体纳米粒混悬液的体积比为1:1‑5:1，室温下搅拌，超声后得到多西环素控释季铵盐壳聚糖‑脂质体复合纳米粒。

【技术特征摘要】
1.一种具有pH响应性的多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）称取壳聚糖粉末，加入NaOH溶液，室温溶胀；再加入二甲基亚砜和碘甲烷，55-65℃反应1-2h，反应后继续分别加入NaOH和碘甲烷，继续反应1h，反应结束后；加入无水乙醇出现白色沉淀终止反应，透析，冻干即得水溶性的季铵盐壳聚糖；（2）称取蛋黄卵磷脂，加入三氯甲烷和无水乙醇溶解，30-40℃水浴加热处理1-2h；再加入溶有胆酸钠和多西环素的PBS缓冲液，在50-60℃水浴中旋转搅拌，超声后得到包载多西环素的脂质体纳米粒混悬液；（3）配制所述季铵盐壳聚糖溶液，缓慢滴加到包载多西环素的脂质体纳米粒混悬液中，边滴加边搅拌，所述季铵盐壳聚糖溶液与脂质体纳米粒混悬液的体积比为1:1-5:1，室温下搅拌，超声后得到多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒。2.根据权利要求1所述的多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中壳聚糖粉末的分子量为15-150kDa。3.根据权利要求1所述的多西环素控释季铵盐壳聚糖-脂质体复合纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中壳聚糖粉末与NaOH溶液的质量体积比为1000:3-1000:5。4.根据权利要求1所述的多西环素控释...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉秋霞，于新波，徐全臣，李玮，范春，胡芳，王蕾，徐烁，
申请(专利权)人：青岛大学附属医院，
类型：发明
国别省市：山东,37