在纤维结的HI环中含有异源肽表位的腺病毒载体制造技术

本发明专利技术提供一种用基因方法改变腺病毒纤维细胞－结合蛋白，来修饰重组腺病毒载体嗜性的方法。本发明专利技术产生了具有修饰的纤维基因的腺病毒，且实现了这种新的嗜性。该重组腺病毒具有ＨＩ环区域被修饰的纤维基因。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒和基因治疗。具体来说，本专利技术涉及的是以特定细胞寻靶同时伴发消去内源向性的目的，制造变形纤维与腺病毒性载体的重组体。相关工艺的描述许多基因治疗应用中采用了重组腺病毒性载体(21,35,38)。主要是因为用此载体能获得体内和体外高水平基因转移。重组腺病毒载体与其它得到的系统区别在于其完成原位基因递送到各种器官中分化靶细胞的独特能力(5,6,9,10,12,20,25,27,29,31)。用重组腺病毒作基因治疗的一个缺点是，此病毒须依赖柯萨基病毒和腺病毒受体(CAR)的存在方能达到高水平的基因转移。在某些环境中，这可能导致重组病毒粒子被高CAR-表达的非把靶细胞所结合，而真正的靶细胞，如果转导差而CAR低的话，则不能结合重组病毒。为了补偿这种结合，需要显著提高所给予的载体的量，这就增加了产生直接毒性和对该载体免疫反应的危险，进一步损害了治疗的总体效果。所以，将目前一代的腺病毒性载体用于基因治疗，可以通过使病毒靶向转导特定的细胞类型，而得到显著的改进。除了这一特性，腺病毒生物学特性妨碍了对这种载体潜能的全面认识。从这一角度来说，亲代病毒对多种组织细胞的广泛嗜性可能使基因传递无法限制于真正的靶细胞。所以，对于需要靶向的、细胞特异性基因递送的许多基因治疗应用而言，腺病毒载体的滥嗜性就成为一种混乱因素。以这种构思为基础，已发展了改变腺病毒天然嗜性的方法，使得衍生的载体能定向输送基因。完成这目的的策略涉及到改变腺病毒感染途径的若干特定步骤。血清型2和5的腺病毒通常通过其纤维蛋白质的羧基末端球形结构域和一级受体相互作用完成初期识别和结合于靶细胞(4,17,36)。结合后，其五邻体碱性蛋白中的RGD基序与αvβ3和αvβ5细胞之间整联蛋白发生相互反应(1-3,37,39,40)。这种反应触发了细胞的内化作用，病毒粒子借此定位于核内体中。核内体的酸化引发了衣壳蛋白的构形变化，与核内体膜相互作用，使得它们形式是小泡破裂和颗粒释出。随着核内体的裂解(endosomolysis)，病毒粒子移位入核，在那里演绎着病毒生命周期的后续步骤。明白了在病毒感染途径中衣壳蛋白所起的重要作用后，提出的策略是通过对衣壳蛋白的修饰来改变这种过程。在这点上，通过修饰编码衣壳蛋白的病毒基因来腺病毒载体基因重靶向，如果成功的话，则提供了对目前一代基因递送运载体进行显著性改进的简单方法。为了这一目的，一些实验小组报道了对腺病毒纤维蛋白该球形结结构域的基因修饰和将这种嵌合纤维掺入到病毒粒子中。例如，Stevenson等报道成功地生成了包含由Ad5纤维的尾及茎结构域和Ad3的该球形结结构域组成的Ad5纤维病毒粒子。另外，Michael等描述了将胃泌素释放肽掺入到重组Ad5纤维的羧基末端。这一发现还被Legrand等进一步扩大，他再生(rescue)了含有这种纤维的重组腺病毒载体。Wickham等描述了含有羧基-末端赖氨酸序列纤维的重组病毒的生成。这些研究确立了这种基因方法的基本可行性，但显示了许多限制因素。所有这些对腺病毒纤维的修饰都是针对该蛋白的羧基端。另外，起初做出这些努力时尚不知道纤维球形结的三维结构(3D)。所以，采用纤维羧基末端是一种未全面加入所有相关考虑的选择。显然，对靶向目的来说，3D结构信息对在纤维结中安定异源蛋白序列关系重大。这种靶向配体的定位如果能够理想地完成，则可以达到表面呈递和对该纤维四级结构的最小干扰。为了克服腺病毒感染受到CRA-依赖性的限制，有人提议将具有受体结合特异性的小肽基序加入到腺病毒纤维蛋白的羧基末端，从而使病毒能通过新的细胞表面受体附着和感染。Wickham等人将这一理论进一步发展，他们制备了几种含有定位于该纤维分子羧基末端靶向配体的纤维的重组腺病毒证明了此方法的可行性。虽然在一些实验中，以载体再靶向为目的的腺病毒纤维羧基端的基因修饰证明了它的用途，但在另一些实验中失败了，提示所定位的纤维分子部位不是加入靶向蛋白分子的最佳位置。已发表的发现强烈指出，在纤维分子的羧基端加上25-30个以上异源蛋白序列的氨基酸残基时，对该纤维三聚体的稳定性有显著的消极作用并且因此与纤维的功能的不相容。另外，该纤维(球形)结的三维结构表明纤维的羧基端朝向病毒粒子而远离细胞表面，故此为靶向配体的加入提供了亚最佳环境。以前本领域不足处在于缺乏重新靶向目的所需的将异源蛋白序列加入到腺病毒纤维结蛋白中的有效方法。本专利技术完成了本领域这一长期的需要和愿望。专利技术概要基因治疗应用中所采用的目前一代重组腺病毒载体可以通过设计能将基因体内递送给所被选定细胞的靶载体而得到改进。为了实现这种靶向，可以将配体加入到腺病毒纤维蛋白中，该纤维蛋白介导了腺病毒与其细胞表面受体的一级结合。根据所提出的该纤维的细胞结合域的结构，该纤维结的HI环可用作异源配体加入的部位。已采用在杆状病毒感染昆虫细胞中表达的纤维蛋白来证明FLAG八肽加入HI环中不会破坏纤维三聚体，也不干扰位于该结中的细胞-结合位点的形成。之后已产生了含有这种修饰纤维的重组腺病毒，而且这种经基因工程掺入此结中的结短肽序列与该纤维的生物学功能相容。此外，通过采用配体特异性抗体，已证明掺入到此结中的肽保留了与本文含有修饰纤维的成熟病毒粒子结合的有效性。这些发现提示异源性配体可以掺入到纤维结的HI环中，而且该(掺入)地点具有的性能与其用于腺病毒重新靶向的策略相一致。由于腺病毒-介导的基因转移给细胞(这种细胞表达了腺病毒纤维受体CAR的临界水平)效率低使得重组腺病毒载体(Ad)的用途受到限制。为了完成在临床上有重要意义的腺病毒载体的CAR-非依赖性基因转移，本文建议通过对病毒纤维蛋白的基因改变来修饰病毒嗜性。本文显示了在纤维结结构域HI环中加入Arg-Gly-Asp(RGD)肽导致病毒在进入细胞过程中利用替代受体的能力。同样也证明了，由于其扩大的组织嗜性，这种新的载体能够有效地转导原代肿瘤细胞。该载体显示向卵巢癌细胞的基因转移增加了2-3个数量级，提示含有掺入了RGD肽的纤维的重组腺病毒可以大量用于治疗缺少一级Ad5受体的肿瘤。本专利技术的一实施例中提供了一种重组腺病毒，其中该腺病毒包含在纤维结的HI环区域被修饰的纤维基因。另一实施例提供了，在需要这种治疗的生物个体杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括如下步骤给予该个体有效量的含有纤维结HI环区域被修饰的纤维基因的重组腺病毒；以及编码单纯性疱症病毒-胸苷激酶的基因；和用9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤治疗生物个体。在本专利技术的又一实施例中，提供了基因治疗需要这种治疗的个体的方法，它包括如下步骤给予该个体有效量的含有纤维结HI环区域被修饰的纤维基因的重组腺病毒和一种治疗基因。本专利技术一实施例中，提供了一种增加腺病毒传导细胞能力的方法，它包括如下步骤在腺病毒纤维结的HI环区域中修饰该纤维基因。从以下为了公开目的而叙述的专利技术优选实施例中，显然可见本专利技术的其它和更多的方面，特点和优点。附图的简要说明为了让上面所述的本专利技术的特征，优点以及专利技术目的等更清楚，在细节上更明白和易理解，可参考附图中所描述的某些实施例对本专利技术的简要总结性说明。这些图是本说明书的一个组成部分。需要指出的是，附图是用来说明本专利技术的实施例的，不能认为是对本专利技术范围的限制。附图说明图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒包含了在纤维结的ＨＩ环区域被修饰的纤维基因。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DT屈里埃尔，VN克拉斯尼坎，I德米特里耶夫，
申请(专利权)人：亚拉巴马大学伯明翰分校研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]