珍稀药用丝状真菌姬松茸Agaricus blazei液体培养制造技术

珍稀药用丝状真菌姬松茸Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ较难进行子实体栽培，也难于液体培养。本发明专利技术以工业化生产为目标，首创性地发明专利技术了廉价高效的种液菌丝培养基配方与液体发酵培养其配方，以及种液培养工艺与液体发酵工艺。并使用可促进该菌生长的专门发酵反应器，（发明专利技术专利：申请号９９１２１８９４．９）。至今，利用本发明专利技术技术可获得该菌最高浓度的细胞产物，发酵液的菌丝以干重计可达１８．５０ｇ／每升。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
药用大型丝状真菌Agaricus blazei姬松茸产于巴西东南部圣保罗的皮埃达山地，当地居民自古用于强身抗病。1967年由Dr.Heireman命名。近年药理及临床研究结果表明A.blazei子实体所含活性多糖类、活性核酸、植物凝集素、甾体化合物及脂类有明显的抗肿瘤作用。并报道姬松茸的提取液可以降低血糖和血压、减轻特异反应、对肝类和爱滋病有改善效果。通过简单摇瓶发酵获得的菌丝体、发酵液的提取物有相同活性(T.mizuno,1995)。美国Health+plus’s and Vesta’s公司已生产用子实体提取物做成的胶囊，用于治疗AIDS病。并报道在美国和墨西哥医院用于治疗癌症病人，包括Ⅳ期病人。姬松茸(A.blazei)采用人工栽培较难，而且子实体培养场所占地面积大，所以人们试图采用液体发酵培养的方法。据文献介绍A.blazei的液体培养也很困难。所以，解决有工业化生产前途的液体培养工艺至今国内外未有报道。本专利技术以工业化生产为目标。首创性地专利技术了廉价、高度的种液菌丝培养基配方与液体发酵培养基配方，以及种液菌丝培养工艺与液体发酵工艺。本技术的发酵工艺可在专门设计用于该菌培养的生物反应器(专利申请号99121894.9)中进行。利用本专利技术技术可获得高浓度的姬松茸细胞产物。实现本专利技术的具体步骤如下①种液菌丝培养基为了刺激姬松茸菌(A.blazei)细胞能以固体培养基培养条件下“转移”到液体条件下生长，试验结果表明必需加入两种促进细胞分化和生长的因子(分别简称为“促进因子”1#、“促进因子”2#)一种是柳树枝去皮后的热水提取液(浓度为20％)以及玉米的提取物(浸泡法浓度30％)。培养基中必需添加前者8.0-10.0％(V/V)，添加后者1.0-3.0％(V/V)。除此以外，为了保证细胞生长的正常营养需要，还应加入1.0-2.0％的葡萄糖(或蔗糖)，(NH4)2SO40.2-0.5％,KH2PO40.05-0.15％,MgSO4.7H2O 0.04-0.08％，以及B类维生素0.0005％。培养基PH值调为6.0-6.5。②液体发酵培养基为了保证姬松茸菌种液菌丝体在液体发酵条件下能继续正常生长而获得较高浓度菌丝量的发酵液，必需加入一种姬松茸固体栽培条件的“类似因子”物质，可由米糠、麸皮、棉籽壳中选取一种或两种廉价成份，制成30％(W/V)浓度热水提取物，培养基中添加量一般为5.0-10.0％即可。其他营养组成有葡萄糖(或蔗糖)2.0-5.0％,(NH4)2SO40.3-0.4％,KH2PO40.1-0.2％,MgSO4·7H2O 0.1％,B类维生素0.0015％。培养基PH值调为6.0-6.5。③一种液菌丝培养工艺一级摇瓶种液培养时用特殊型摇瓶(长颈球形摇瓶)代替常用的锥形瓶，有利于菌丝在液体培养条件下的生长，装液量为25％。为了同样目的，必需使用往复式摇床代替常用的旋转式摇床，频率为90-120次/分。培养温度25-30℃，培养周期2-3天为宜。二级种液菌丝培养反应器装液比为60％。通风比控制在1∶0.5-1.0vvm，PH控制在5.0-6.0。培养温度25-28C。周期1-2天为宜。④液体发酵培养工艺姬松茸液体培养采用气升环流反应器，最好在具有低回流区的气升式发酵反应器中进行(专利申请号99121894.9)，控制参数装液量70％，可用较低的接种量8％，在低回流导流筒结构由通风比值，培养的前、中期为1∶1.0vvm，后期为1∶1.5vvm。严格控制培养PH值6.0-5.5。培养温度26-28℃。培养过程中产生泡沫过剧，可用适量的二级豆油进行消沫处理。⑤为实现本专利技术姬松茸菌A.blazei液体培养，所采用的发酵反应器为气升环流反应器，最好采用低回流气升式反应器ALR/ff(详见专利技术专利申请号99121894.9)。大型丝状真菌的液体培养，由于菌丝体易破损及菌团结壁而不应沿用传统的机械搅拌罐。而普通的空气鼓泡反应器又效率很低。通过试验研究，针对该菌的菌丝形态及生理特征，为A.blazei设计了内导流筒低回流区空气提升式生物反应器。其主要设计参数为，Ad/Ar(下降区截面积与上升区截面积之比)1.1-1.5(对于种液菌丝培养反应器可取较高值)；h/H(导流筒高度与反应器高度之比)≤0.45(对于种液菌丝培养反应器可取较低值)。该型生物反应器的独特设计保证了姬松茸菌A.blazei液体培养条件。实施例一生物反应器用ALR/ff型低回流气升反应罐。其参数为Ad/Ar=1.158,h/H=0.420。取培养20天的斜面培养物2cm2，接于种液摇瓶。种液摇瓶的培养基中(％)，含有“促进因子”1#,9.0，“促进因子”2#,2.0，葡萄糖1.5,(NH4)2SO40.35,KH2PO40.08,MgSO4.7H2O 0.05，维生素B类0.0005，培养基PH6.5。培养温度26℃，往复摇床频率110次/分。培养3天。以8％接种量接入ALR/ff发酵培养器。发酵培养基中(％)含有米糠提取液6.0，葡萄糖2.5,(NH4)2SO40.35,KH2PO40.15,MgSO4·7H2O0.1,B类维生素0.0015，培养基PH6.5。装液量70％。培养前4天，通风比为1∶1.0v.v.m，后期1∶1.5v.v.m。发酵温度27℃。培养6天，发酵PH值达5.4。最终发酵液的菌丝干重可达12.80g/每升。实施例二本实施例中，其他条件与实施例一相同，仅改变发酵培养基中的米糠提取物，即用量增加一倍(12％)。同样温度发酵6.5天。最终发酵PH值达5.2，发酵液的菌丝干重可达18.50g/每升。权利要求1．一种真菌液体培养的方法，其特征在于可适用于丝状真菌的液体发酵，尤其是姬松茸的液体发酵工艺，本工艺的培养基包括含有碳源和氮源的二级种液菌丝培养基和液体发酵培养基，培养基中含有促进细胞分化和生长的因子。2．根据权利要求1所述的姬松茸的液体发酵培养的工艺方法，其特征在于姬松茸种液菌丝培养的碳、氮源培养基包含葡萄糖或蔗糖1.0-2.0％,(NH4)2SO40.2-0.5％,KH2PO40.05-0.15％,MgSO4·7H2O 0.04-0.08％,B类维生素0.0005％，培养基的PH值范围为6.0-6.5。3．根据权利要求1所述的姬松茸的液体发酵培养的方法，其特征在于姬松茸液体发酵的碳、氮源培养基包含葡萄糖或蔗糖2.0-5.0％,(NH4)2SO40.3-0.4％,KH2PO40.1-0.2％，B类维生素0.0015％，培养基的PH值范围为6.0-6.5。4．根据权利要求1所述的培养基还要添加促进细胞分化和生长的因子，其特征在于是一种柳树枝的浸提液和玉米的提取液(即“促进因子”1#和“促进因子”2#)。5．根据权利要求4所述的柳枝浸提液促进细胞分化的因子，其特征在于去皮的柳树枝浸提液更好，浸提时，固液比为20％(w/v)，浸提液在种液菌丝体培养基中的添加量以8.0～10.0％(v/v)为宜。6．根据权利要求4所述的培养基添加玉米浸提液的促进细胞生长的因子，其特征在于玉米浸提液最好采用新鲜玉米。浸泡时，固液比为30％(w/v)，在培养基中的添加量以1.0％～3.0％(v/v)为宜。7．根据权利要求1所述的液体发酵培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种真菌液体培养的方法，其特征在于可适用于丝状真菌的液体发酵，尤其是姬松茸的液体发酵工艺，本工艺的培养基包括含有碳源和氮源的二级种液菌丝培养基和液体发酵培养基，培养基中含有促进细胞分化和生长的因子。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚建华，苏华，杜遵义，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]