用于蕈菌液体深层发酵控制的方法技术

为了克服现今蕈菌类液体深层发酵工艺不完善、生产效率低的弊病。本发明专利技术针对蕈菌类丝状细胞的生理生化、形态及代谢特征，首先采用控制蕈菌细胞生长比速率的反馈控制补料培养、液流控制连续培养手段，用于药用蕈菌灵芝类液体深层发酵，以优化大型丝状真菌液体深层培养的细胞生成浓度、细胞生成效率，从而提高发酵水平。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】灵芝(包括红芝、紫芝等)是我国分布广、医学价值高的一类药用蕈菌。《神农本草经》、《本草纲目》中早有灵芝的记载，它是民间用之已久的中草药及滋补品。近代化学分析研究表明，它含有许多种功能成份，对中枢神经、循环系统、呼吸系统、肝脏等有重要的扶正培本”作用。近年来，关于灵芝的药理与生理作用有了更深入的研究及临床结果，以灵芝为原料所制备的具有药疗或辅疗作用的管养药剂Nutriceutical”愈益受到人们的重视和关注。灵芝子实体栽培工艺难以实现工业化生产，加之子实体的木质化使其有效成份又很难完全提取而被利用。不断的研究结果又表明，液体深层培养的菌丝培养物与子实体有相同的临床效果。而且液体培养过程中胞外代谢产物的有效成份可分泌与保留在培养液中，但是栽培工艺中子实体细胞的有效代谢成份的一部份却散失到不能被利用的固体栽培基质中。由于上述种种原因，国内外(如日本、东南亚，包括一些西方国家)加强对灵芝类液体深层发酵工艺的研究开发。但是至今其液体发酵工艺仍沿用子实体栽培工艺中菌丝种液摇瓶培养方法放大的分批发酵技术，存在工艺不完善、生产效率低的弊病。药用蕈菌(大型丝状真菌)细胞在液体深层培养体系中的形态学特征明显不同于细菌或放线菌，易形成不同分支程度的纤长菌丝，进而菌丝间又发生不同紧密度及空间度的缠绕。培养体系中液流的物理因子与化学因子(液流类型、剪切力、黏度、固相物特性、气相物特性、基质浓度、酸度等)的干扰作用可引起菌丝的断裂、分支特征的改变，导致细胞生长比速率(单位细胞量的细胞生成速率)的下降；以及由于细胞菌丝自身缠绕成絮团，引起细胞集合颗粒内部的物质传递阻力增大，而使内部细胞缺少溶解氧及营养，也导致细胞生长比速率的下降。所以，蕈菌细胞在液体深层培养体系中，生长比速率的控制显得更为重要。针对蕈菌类丝状细胞的生理生化、形态及代谢特征，采用本专利技术的工艺手段，可以调整蕈菌细胞在液体深层培养体系中生长比速率值在优化控制的范围内，以提高大型丝状真菌液体深层培养的细胞生成浓度、细胞生成效率，从而改善发酵水平。丝状真菌灵芝含有许多种功能蛋白、多糖、有机酸、生物碱、香豆素、甾麦醇以及甙类等有效生物活性物质，成份复杂，药效广泛。取其单一成份，则药效降低。所以，从药理学观点看，药用丝状真菌发酵液是一种综合抗病因子制剂，对于这种复杂的活性因子培养体系，常用菌体生长作为发酵及其代谢过程优劣的相关指标。发酵生产中，由于产品目标不同，有的以细胞生成浓度(即单位体积发酵液中的细胞量)为指标；有的以细胞生成效率(即单位时间内单位体积发酵液中的细胞量)为指标。本专利技术的实施过程如下。从发酵工程学观点，分批发酵是一类封闭式培养体系(即培养过程中无料液的输入和输出)。细胞菌丝进入新鲜营养基后的生长比速率在逐步达到最大值后，即随着培养液中营养基质浓度的下降而明显降低。采用单元反馈补料控制方法对培养体系输入新鲜营养基可以不断改善细胞的基质环境，使细胞菌丝生长比速率保持在一个较佳范围而持续一段较长培养时间，达到优化目的。采用的方法步骤是按如下给出的培养基。灵芝液体深层发酵以蔗糖为碳源的发酵培养基的组成中，初始蔗糖浓度为0.8-1.5％。培养基中其他组成(％)玉米浆1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB1 0.0015，自然pH。接种培养，培养温度28℃，pH控制在4.8-5.5。发酵体系中的还原糖浓度降为0.3-0.5％时，开始往发酵体系内流加浓度为15％的蔗糖溶液。发酵过程中每隔4小时(每4小时作为一个单元时间)，取样离线检测还原糖浓度，并计算发酵体系该单元时间的平均耗糖速率。据体系中糖浓度的变化速率，反馈调整下一单元时间的补糖速度，使发酵体系中的还原糖维持浓度始终保持在0.6-0.8％范围内。发酵体系中单元时间平均耗糖速率的计算方法如下由上次取样时间到这次取样时间之间的单元时间为4小时。该4小时的平均耗糖速率记为M，则 M＝(V1)(s1)(1/4)－(V2)(s2)(1/4)＋(d)(v)，设定V1 上次取样时间的培养液体积s1 上次取样时间测得的还原糖浓度V2 这次取样时间的培养液体积s2 这次取样时间测得的还原糖浓度d 流加蔗糖溶液的还原糖浓度v 该单元时间的流加速度v*下一单元时间的流加速度(其中培养液体积是时间变量，等于初始培养液体积与已补料液体积之和)，然而，调整下一单元时间的流加速度v*＝(M)/(d)。该补料操作持续3-4天，在这培养期间，细胞菌丝生长比速率的变化区间可始终被控制在0.030-0.060(l/h)较佳范围内。从工艺学观点，这是一种半开放、变体积的补料发酵操作体系。目前有关灵芝液体深层发酵报道用的都是分批发酵技术，其发酵液中细胞终浓度(纯细胞绝对干重计)为6-10克/立升左右。用上述工艺技术，细胞浓度可较分批发酵的报道值最高增加到2倍以上，细胞生成效率也可较分批发酵提高到1.5倍以上。另外，在目前缺乏即允许在线灭菌、又质量可靠的还原糖测定电极的情况下，该方法更为实用有效。当然，我们进一步也可以控制细胞菌丝生长比速率维持在一个相同的较佳值，即采用恒定连续液流控制方法，对培养体系以选定速度连续输入新鲜营养基、同时以相同速度连续输出发酵液，则可以提供一个基本相同的、良好的细胞生长基质环境，使细胞菌丝生长比速率保持一个相同的较佳值、并持续整个培养时间，达到优化目的。采用的方法步骤是按如下给出的培养基。灵芝液体深层发酵在以工业葡萄糖为碳源的发酵培养基组成中，葡萄糖的初始浓度为0.8-1.2％。培养基中其他组成(％)玉米浆1.5，KH2PO40.20，MgSO40.08，VB1 0.0015，自然pH。培养温度28℃，pH控制在4.8-5.5。接种培养14小时后，开始从培养体系的进料口连续地以恒定速度(料液流动速率)输入新鲜培养基(配方与初始培养基组成相同)，与此同时以相同恒定速度、连续地由发酵体系向外输出并收集发酵液，维持发酵体系的恒定体积。料液流动速率值的选择应满足如下条件，选用的某一料液流动速率值使相应的某一稀释率”参数值应在0.030-0.060(l/h)范围内。它们的定量关系为/＝。其中，料液流动速率的单位，发酵液恒定体积的单位，稀释率的单位。其结果，细胞菌丝的生长比速率可以始终以一个较佳值持续整个培养时间，数值上应等于所选定的稀释率参数值。这样，细胞生长比速率被控制在0.030-0.060(l/h)范围中的一个选择值上。发酵体系的排出液(即产物)的细胞生成效率可较分批发酵的报道值提高到2倍以上，而分批发酵细胞生成效率值常为0.06-0.08克/立升/小时(以纯细胞绝对干重计)。从工艺学观点，这是一种全开放、恒体积的连续发酵操作体系。这样的操作体系，可使生产周期明显延长，并节约单批生产时的反应器前期处理、种子培养等相应步骤。本技术的方法特别适用于对灵芝(如赤芝Ganoderma lucidum、紫芝Ganoderma sinense)以及姬松茸Agaricus blazei类的工业化生产。为了能达到满意的结果，使用ALR/ff生物反应器(专利申请号99121894.9)进行上述发酵过程的效果可以更好。实施例一在2.5立升生物反应器中，培养基初始体积1200ml。发酵培养基组成(％)食用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于蕈菌液体深层发酵的控制方法，其特征在于，发酵过程采用控制细胞菌丝生长比速率在０．０３０－０．０６０（ｌ／ｈ）的范围内。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：龚建华，王义军，杜遵义，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]