巴西虫草菌丝体深层发酵培养方法技术

本发明专利技术公开了一种巴西虫草菌丝体深层发酵培养方法，以巴西虫草菌种为出发菌，采用新研制的培养基配方，在适宜的温度、搅拌速度、酸碱度等培养条件下，生产虫草菌丝体，菌丝体经干燥后制得纯虫草菌丝粉。利用该方法生产的虫草菌丝粉与天然虫草的主要成分和药理作用基本一致，并且该工艺可进行大规模生产，生产成本低，具有较高的开发价值。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物发酵领域，更具体地说是关于一种。
技术介绍
冬虫夏草(Cordyceps Sinesis(Berk)Sacc)是一种名贵滋补强壮药，它具有广泛的药用价值，如增强细胞免疫和体液免役功能，雄性激素样的作用等。但天然虫草来源有限，价格昂贵。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用巴西虫草菌种经深层发酵生产虫草菌丝粉的方法。本专利技术的目的是通过如下的技术方案解决的利用巴西虫草菌种，采用新研制的培养基配方，在发酵罐中通气培养，控制适宜的温度、搅拌速度、酸碱度等培养条件，发酵生产虫草菌丝体，菌丝体经干燥后制得纯虫草菌丝粉。方法主要包括摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养，具体工艺如下(1)摇瓶培养接入巴西虫草菌种，在22-32℃，摇床转速120-300转/分的条件下，培养3-6天后，接入种子罐培养；(2)种子罐培养将摇好的摇瓶种子接入种子罐中，接种量1-15％，在22-32℃，搅拌速度150-500转/分，罐压0.03-0.12兆帕，风量1∶0.3-1∶1.2体积/体积/分的条件下，培养1-4天；(3)发酵罐培养将已培养好的种子接入发酵罐，接种量为5-20％，在22-32℃，搅拌速度150-350转/分，罐压0.02-0.12兆帕，风量1∶0.3-1∶1.2体积/体积/分，pH6.5-8.0的条件下，培养3-6天，得虫草菌丝体，干燥得虫草菌丝粉；其中所用的的培养基组分及重量百分含量为淀粉0.5-4％、糖0.75-2％、蛹酪素0.5-4％、无机盐0.01-0.2％，pH 6.5-8.0，固体培养基加1-2％琼脂。本专利技术所述的方法中培养基的组分及重量百分含量的优选方案为淀粉0.8-3.5％、葡萄糖0.8-1.8％、蛹酪素0.8-3％、MgSO4及K2HPO40.03-0.1％，pH 6.5-8.0，固体培养基加1-2％琼脂。本专利技术中所用的巴西虫草菌种是从天然冬虫夏草经常规的组织分离、驯化培养而得到。利用该工艺方法得到的虫草菌丝粉主要成份和药理作用与天然冬虫夏草基本一致微量元素Cu、Zn、Sr等的含量大体一致；富含的19种人体必需氨基酸中，除门冬氨酸、组氨酸、精氨酸外，其余基本一致；主要有效成份D-甘露醇、麦角甾醇、虫草多糖的含量虫草菌丝粉略高于天然冬虫夏草；两者在增强细胞免疫、体液免疫及雄性激素样方面的药理作用相近；该工艺生产的虫草菌丝粉对CCl4诱发的肝损伤有一定的保护作用。该工艺可进行大规模生产，生产成本低，具有较高的开发价值。该工艺生产的虫草菌丝粉与天然虫草的主要成分与药理作用基本一致，为其代替天然虫草奠定了基础。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术的方法作进一步的说明。实施例1(1)摇瓶培养50升的种子罐，以装量30升计，接种量3％，则配摇瓶培养基的量为30升×3％＝0.9升。按淀粉1％、葡萄糖1％、蛹酪素1％、MgSO40.05％、K2HPO40.05％、pH6.8的配方，配0.9升培养液，分装在500毫升三角瓶中，每瓶装量为100毫升，装好后灭菌，冷却至30℃，接入试管种。每瓶接入种块2块约0.5平方厘米。摇床转速为180转/分，控制温度为25℃，经4天培养后，接种至50升种子罐培养。(2)种子罐培养50升的种子罐实装量为30升，减去摇瓶种量0.9升，则为30-0.9＝29.1升。按本实施例(1)所述配方，配29.1升培养基(实际只加水至26升，预计灭菌时有3升的蒸汽冷凝水)，培养基灭菌后，待温度降至30℃时接入摇好的摇瓶种子，接种量为10％，控制种子罐的温度为25℃，搅拌转速为300转/分，通风量为1∶0.5体积/体积/分，罐压为0.05兆帕，培养2天后，种子罐种子接种至500升发酵罐中发酵培养。(3)发酵罐培养500升发酵罐以实际装量为300升计，减去种子罐的量30升，实际发酵罐需配培养液的量为300-30＝270升。按本实施例(1)所述配方配270升的培养基于500升发酵罐中(实际只加水至260升，预计约10升的蒸汽冷凝水)，灭菌，待温度下降至30℃时把种子罐中已培养好的种子接入发酵罐中，接种量10％，控制发酵罐温度为25℃，搅拌转速为200转/分，通风量为1∶0.4体积/体积/分，罐压0.05兆帕，培养5天后，即获得巴西虫草菌丝体，干燥，得纯巴西虫草菌丝粉，得率1.76％。实施例2 虫草菌丝粉与天然虫草的主要成分比较表1、表2、表3分别是虫草菌丝粉与天然虫草的主要有效成分、微量元素、氨基酸含量的比较。表1虫草菌丝粉与天然虫草的主要有效成分含量比较 表2虫草菌丝粉与天然虫草的微量元素含量比较 表3虫草菌丝粉与天然虫草的氨基酸含量比较 从上面的表1、2、3的结果看，作为冬虫夏草的主要有效成分D-甘露醇(虫草酸)、麦角甾醇(虫草素)、粗多糖，其含量虫草菌丝粉略高于天然冬虫夏草。氨基酸含量两者基本一致，微量元素含量相差也不大，说明两者所含化学成分基本一致，为虫草菌丝粉代替天然虫草奠定了基础。实施例3 虫草菌丝粉与天然虫草的药理作用比较(1)对免疫器官重量和白细胞的影响取体重12±2g的NIH系小鼠80只，均分8组，每组10只，按不同剂量灌胃给药，qd×7d，容量0.2ml/10g，对照组给予等容量蒸馏水。免疫低下第5-8组则于给药后第4天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，末次给药1h后眼眶取血记数白细胞，并颈椎脱位处死动物剖取胸腺，脾脏用扭力天平称湿重，计算免疫器官指数(mg/10g体重)，结果见表4。表4对免疫器官重量和白细胞的影响比较 与蒸馏水+环磷酰胺组比较△P＜0.05 △△P＜0.01(下同)结果表明，虫草菌丝粉和冬虫夏草对正常免疫器官胸腺、脾脏及白细胞数均有增加的趋势，但统计学无显著的意义。而免疫低下组的胸腺、脾脏则有明显增重作用，且对环磷酰胺所致白细胞的降低有升高作用，与对照组比(P＜0.05和0.01).其作用在一定范围内随剂量增加而加强。(2)对小鼠碳廓清速率的影响取体重18±2g小鼠40只随机分四组，每组10只，按不同剂量灌胃给药，qd×7d。对照组给等容量蒸馏水，末次给药后1h静脉注射印度墨汁0.1ml/20g，注射后2分钟和20分钟分别从眼眶取血20微升放入0.1％Na2CO32ml溶液中摇匀，用RA-50自动化学分析仪波长670nm测OD值，计算碳廓清指数K值，结果见表5。表5对小鼠碳廓清速率的影响的比较 与对照组比*P＜0.05 **P＜0.01(下同)结果表明虫草菌丝粉各组均能增加碳廓清指数，其中8g/kg组与对照组比差异显著(P＜0.05)，提示该产品能显著提高机体对网状内皮系统的吞噬功能。(3)对小鼠体内淋巴细胞转化功能的影响取小鼠40只，随机分四组，每组10只，按不同剂量灌胃给药，qd×7d。各组给药第3天肌肉注射PHA6mg/kg，连续注射3天。除蒸馏水组外，各组于注射PHA第2天均腹腔注射环磷酰胺一次50mg/kg，末次给药后剪尾取血推片。瑞氏—吉姆氏染色，计算100个淋巴细胞中转化细胞百分数，比较组间的差异，结果见表6。表6对小鼠体内淋巴细胞转化功能的影响的比较 结果表明，虫草菌丝粉4和8g/kg及冬虫夏草均能显著地提高小鼠体内淋巴细胞转化率，对抗环磷酰胺抑制淋巴细胞的转化作用，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种巴西虫草菌丝体深层发酵培养方法，包括摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养，其特征在于：（１）摇瓶培养：接入巴西虫草菌种，在２２－３２℃，摇床转速１２０－３００转／分的条件下，培养３－６天后，接入种子罐培养；（２）种子罐培养：将摇好的 摇瓶种子接入种子罐中，接种量１－１５％，在２２－３２℃，搅拌速度１５０－５００转／分，罐压０．０３－０．１２兆帕，风量１∶０．３－１∶１．２体积／体积／分的条件下，培养１－４天；（３）发酵罐培养：将已培养好的种子接入发酵罐，接种量为５－ ２０％，在２２－３２℃，搅拌速度１５０－３５０转／分，罐压０．０２－０．１２兆帕，风量１∶０．３－１∶１．２体积／体积／分，ｐＨ６．５－８．０的条件下，培养３－６天，得虫草菌丝体，干燥得虫草菌丝粉；其中所用的的培养基组分及重量百分含量为：淀粉０．５－４％、糖０．７５－２％、蛹酪素０．５－４％、无机盐０．０１－０．２％、ｐＨ６．５－８．０、固体培养基加１－２％琼脂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁淑娃，彭中健，杜少平，杨冠东，
申请(专利权)人：广州市微生物研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]