大型丝状真菌子实体栽培的液体菌种的培养方法技术

本发明专利技术提供必要的动态可控制培养技术，采用开放式培养体系进行灵芝种液培养，选定连续性物料流速率与培养体积之比的特定动态参数值稀释率，可以控制大型真菌菌丝形成不同的形态品质，以满足子实体栽培种液的需要。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
以灵芝为代表的药用大型丝状真菌是我国医药的传统组成部分，真菌药物的研制是药物研究开发的一个重要内容。长期以来，愈来愈多的大型丝状真菌被证明具有药用价值。目前药理研究结果表明灵芝类药用丝状真菌含有多糖体、多肽类、糖苷肽、生物碱、醌类、类固醇类、萜类、嘌呤类、有机酸等有效成份而有明确的药疗及辅疗作用。以灵芝子实体为材料研制开发的药剂或辅疗药剂在临床、辅助治疗及保健等方面有明显的效果。例如用灵芝子实体提取物或孢子粉制成的治疗或辅疗产品已占有可观的市场份额。药用灵芝类的子实体生产是一种传统的栽培工艺，但也在实践中不断改进以适应新的要求。传统栽培工艺中常用固体培养基质培育菌苔种(制成片状，块状，球状等)进行子实体栽培，由于其技术局限性及其低效率，目前已逐步用液体培养法制备液体种子(即菌丝集合体的悬浊液)取而代之，使子实体栽培过程能达到周期短、发菌快、菌龄一致，以及操作方便，成本低的目的。然而作为栽培用种的具有良好品质的液体培养物，对菌丝形态、菌丝均匀度等有相应的品质要求。但是现所采用的摇瓶分批培养或反应器分批培养法的技术可控程度有限，所制得种液的菌丝形态及其品质难以稳定。而且通常用液体种栽培时要求用液量较多，上述制作法效率低，不能满足大生产的要求。针对上述薄弱环节，本专利技术以发酵工程学原理为基础调整现有的培养过程控制策略。本专利技术的技术基础可以概述如下，大型丝状真菌(蕈菌)液体深层培养体系中，不同培养条件时的细胞集合形态可以成细浆状、絮体浆状、絮状、絮团状以及颗粒状(直径0.5mm-3.mm不等)。其形态特征与生长的环境因子密切相关。环境因子包括，液体培养基组成及其浓度、固/液/气三相培养体系的液流特征、不同生长阶段细胞所承受的剪切力、以及PH化学因子等。环境因子影响细胞的复制、分裂过程，就形态学可表现为线性生长或分支生长；另一方面，物理因子及化学因子又可改变这些纤维状菌丝物的聚并模式。细胞生长的动力学差异，在宏观上表现为生长比速率(即单位细胞量的生长速率)的差异。物料流连续培养体系，提供了可以通过物料流动态参数直接调整细胞生长比速率的控制手段，从而影响细胞的生长直至形态品质，提供不同子实体栽培时所需种液。在灵芝栽培用种液的制备中，常用的(摇瓶或反应器)分批培养，从生化工程学观点，它是一种闭合型培养体系，即在培养过程中培养体系无料液的进入或排出。用这样的体系制备子实体栽培用液体种子，主要靠调整培养基或添加增稠剂为主要手段来控制培养液中丝状细胞物的形态、均匀度等，所以可控手段有限。而本专利技术采用培养过程中始终同时发生有物料的输入及输出的开放型培养体系，动态物料流的特征直接关连并控制细胞的生长与代谢。输入的物料由培养基组成。调节物料流对培养体系的稀释率可以改变细胞群体的生长比速率。稀释率D定义为物料流速率与体系培养体积的比值(即稀释率D＝F/V，F物料流速率，V培养体积)，稀释率的单位为，物料流速率单位为，培养体积单位为。改变物料流速可以控制稀释率。选定灵芝培养体系稀释率的特定值是该技术的重要内容。在国内外仍沿用分批法制备灵芝栽培用种液的情况下，本专利技术确定了灵芝种液动态物料流培养体系的物料流参数值，完成开放型培养体系制备灵芝种液技术。其主要技术特点在于1)种液的菌丝形态品质可通过特定值控制；2)形态品质稳定；3)制备效率高。本专利技术实施过程如下。灵芝种液的培养基，采用葡萄糖为主要碳源，玉米浆为主要氮源，组成如下(％)葡萄糖0.5，玉米浆1.0，KH2PO40.15，MgSO40.05，VB10.001，自然PH。输入用物料流的组成如下(％)葡萄糖0.8，玉米浆1.0，KH2PO40.15，MgSO40.05，VB10.0018，自然PH。培养基和输入物料的灭菌温度121℃30分。培养温度28±1℃，培养体系PH控制在4.5-5.5。接种量10％。生物反应器通风量1.0-2.0v.v.m.。接入初级种液(PDA培养基)后，经过一天培养，开始物料的输入，同时有培养液的输出，输入速率与输出速率始终保持相同，形成恒定的物料流状态。改变物料流速率即可控制稀释率值、从而影响生长比速率。本专利技术可根据子实体栽培要求选定以下的稀释率及相应的菌丝形态稀释率的A B C D特定值 0.020-→0.040-→0.055-→0.200-→0.350菌丝培养液A范围(短菌丝)细浆状的形态特征B范围(长菌丝)絮体浆状C范围(缠绕的长菌丝)蓬松的雪花状菌丝簇D范围(成团的长菌丝)颗粒状，直径0.5-2.0mm上述每一范围内随着稀释率的增加、其形态特征是一个渐变过程，例如A范围内值越大则越接近B状态。控制上述特定值可获得相应形态品质的均匀性液体菌种。在保持无菌培养条件下，物料流可连续10-15天。除了采集培养体系的连续输出液，当终止反应器培养时，反应器内所剩余的整罐培养液也是相同的产出液。用该技术制备灵芝液体种液的细胞生成效率为0.12-0.20克/立升/小时(以纯细胞绝对干重计)，较摇瓶或反应器分批培养法相应地提高到1.5-2.倍。种液产出量也大，例如，一个2立升的反应器连续工作10天，产出菌液20,000ml。由于子实体品种不同、固体栽培时或用段木栽培法或瓶栽、袋栽法，基质用料也各异，对液体种液有相应的形态品质要求，可选用合适的稀释率特征值。通常灵芝袋栽法工艺中用0.040-0.055(l/h)特征值较好。为了获得满意的种液，实施本技术时可使用AlR/ff生物反应器(专利申请号991218949)。实施例取培养10天的灵芝菌(Ganoderma sinense)斜面(PDA固体培养基)接于250ml三角摇瓶中(PDA液体培养基)，置往复摇床28℃培养3天，该培养物为初级种液。用2立升体积的AlR/ff生物反应器，装液量1.6立升。培养基组成如下(％)工业葡萄糖0.5，玉米浆(工业用)1.0，KH2PO40.15，MgSO40.05，VB10.001，自然PH。输入物料的组成(％)工业葡萄糖0.8，玉米浆(工业用)1.0，KH2PO40.15，MgSO40.15，VB10.0018，自然PH。料液灭菌温度121℃30′。反应器先经空消后，用无菌操作法接入1.6立升无菌培养基及5％接种量的初始种液(即80ml)。培养温度28℃，PH控制值4.5-5.5，通风量1∶1.5v.v.m。24小时后开始以80ml/h速率输入物料，并用同样物料流速率从反应器内输出培养液。根据上述关系式(即稀释率D＝F/V，F物料流速率，V培养体积，稀释率的单位为，物料流速率单位为，培养体积单位为)，据上式计算求得，此时培养体系的稀释率等于0.050。24小时开始收集输出液即液体菌种(制备的产物)。整个制备体系都保持无菌状态，以确保纯种培养过程以及收集液的无菌要求。连续培养10天后共制备无菌液体种液19,200ml左右，加上反应器内1600ml，共收获约20,000ml。菌液为浅白色絮状浆液长菌丝。镜检菌丝整齐、粗状、较长，已有部份菌丝缠绕。每袋固体栽培基质接入上述种液15ml，按灵芝子实体栽培常用工艺进行常规培养，1个半月左右可采集子实体。用本专利技术的种液接种，灵芝子实体具有生长快、效率高、生长齐整的优点。参考文献1)赵继鼎《中国灵芝新编》，科学出版社，1989本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备大型丝状真菌子实体栽培的液体菌种的培养方法，其特征在于：液体菌种的培养是在有物料输入，同时又有培养液输出的开放式培养体系，同时输入与输出的物料流是保持相同的速率。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：龚建华，王义军，杜遵义，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]