重组方法及其所用试剂技术

本发明专利技术一般涉及重组至少两个核酸序列的方法及其所用试剂。更具体地，本发明专利技术涉及在表达ｒｅｃＢＣＤ核酶或其功能衍生物的宿主细胞中重组环形核酸序列和线形核酸序列的方法。本发明专利技术的方法可特别地用于通过与线形ＤＮＡ序列同源重组来修饰细菌人工染色体。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及重组至少两个核酸序列的方法及其所用试剂。更具体地，本专利技术涉及在表达recBCD核酶或其功能衍生物的宿主细胞中重组环形核酸序列和线形核酸序列的方法。本专利技术的方法可特别地用于通过与线形DNA序列同源重组来修饰细菌人工染色体。有必要更进一步地了解高等真核生物基因组的结构和组成。基因组序列经常比编码序列长很多。尽管仍不知道大多数非-编码序列的功能，但它们显然在调节基因表达，稳定性和进化方面起着重要作用。与非相关的或病毒启动子所驱动的cDNA构建体形成对照的是，大基因组片段的基因转移显示出正确的时间-和组织-特异性基因表达1-7。酵母人工染色体(YAC)已提供了很多疾病基因的基因组克隆8-10。具有多种人基因座YAC的转基因模型已阐明这种大的基因组片断可用于产生多种疾病的准确模型11-14。酵母中高效率的同源重组对于基因操作YAC以进行功能分析3，8，15，将YAC环化成PAC或BAC16，17和由较小的重叠YAC产生较大的YAC具有重要的意义。然而，YAC系统存在几个严重妨碍其应用的局限性。YAC具有高水平的克隆不稳定性和嵌合状态19，20。另外，尽管已研究出多种方法用于产生YAC转基因学，但仍难以纯化转基因所用的完整的YAC DNA21。用于在YAC中导入修饰或者用于进行TAR克隆的酵母同源重组系统的重要缺点22是难以调节同源重组的程度，并且需要筛选大量“重组”克隆以鉴定正确的产物。大-插入物BAC/PAC克隆系统23，24已克服了YAC系统的很多难题。BAC/PAC已越来越多地用于长-范围的物理图谱绘制25，26，疾病基因的定位克隆27，整个基因组测序计划28-30和功能研究31，32。由于细菌中的克隆效率更高，因此相对于YAC文库而言，高质量BAC/PAC基因组文库的构建更加容易。在已被详尽-定义的重组-缺损的大肠杆菌菌株DH10B中，每个细胞内可维持1-2拷贝的BAC/PAC，在该菌株多代的繁殖过程中，BAC/PAC表现出较高的克隆稳定性。尽管BAC/PAC携有大小约为300kb的插入物，但仍可以通过常规的细菌质粒分离方法大量纯化BAC/PAC以进行功能研究。这些克隆中的基因组插入物大得足以能维持大多数人基因座的完整性，因此对于功能研究来说较为理想。尽管存在这些优点，而且BAC/PAC作为在很多系统中进行基因组研究所需的重要工具越来越受欢迎，但仍没有简单易行的技术能对这些克隆进行基因操作。这些克隆中基因组插入物较大，这一点阻碍了在常规的基础上发现合适的限制性位点。1989年，人们首次使用大肠杆菌基于F-质粒的载体中的同源重组来连接重叠的果蝇粘粒片断以形成125kb片断35。在rec+菌株中，具有温度敏感型复制起点的穿梭质粒之间共-整合，而分辨共-整合需要rec-宿主中的第二个位点-特异性重组事件。Sternberg34描述了将真核生物的选择标记转座插入大的P1克隆的方法，尽管难以精确控制转座位点，但该方法应该也适用于PAC和BAC。已成功使用借助于RecA的限制性内切核酸酶(RARE)裂解法在大量P1和BAC克隆中导入修饰35，但此方法在技术上很受限制。由于PAC和BAC克隆系统在每个载体的骨架上都包括loxP位点，很多研究人员用cre重组酶将真核选择标记和报道基因靶向插入此位点36，37。Yang等38报道了使用具有温度敏感型复制起点的穿梭质粒中的野生型recA基因靶向修饰131kb BAC，从而赋予DH10B细胞瞬时的精通重组的能力。然而，有证据表明使用此方法显著重排克隆必需通过Southern印迹鉴定重组克隆以鉴定出正确的产物。另一种使用大肠杆菌CBTS菌株的方法也被用于在含有完整的小鼠CMV基因组的230kbBAC中导入修饰39，其中所述菌株的recA基因中携有温度-敏感型琥珀突变。然而，难以将BAC由DH10B直接转移至条件recA菌株。最近，有人使用含有适当定向的chi位点的靶向构建体，将绿色荧光蛋白基因靶向至含有GATA-2基因座的斑马鱼BAC40。然而，这必需将BAC转移至精通重组的菌株，这可能会导致具有重复序列的克隆的不稳定性。还有人描述了用噬菌体λ的Red-Gam系统替代大肠杆菌的RecBCD功能的方法41。这种替代使得宿主染色体和短的线性DNA片断之间同源重组的发生率比recBCsbsBC或recD菌株所表现出的高至少70倍。然而，仍未阐明该系统修饰BAC/PAC的用途。上述方法无一最适于对PAC和BAC进行基因操作。它们不能在表达RecBCD的宿主细胞(如DH10B)中直接使用，或者还需要构建复杂的穿梭载体。在大多数这些方法中，不能较好地控制同源重组的程度，因此会出现不必要的重排风险。所以，需要开发出以可控制的方式直接在宿主细胞中使两个核酸序列，如BAC/PAC与线性DNA序列重组的方法。在导致本专利技术的工作中，专利技术人探求开发一种在体内使两个核酸序列(如环形DNA序列)与线性DNA序列可控同源重组的方法。特别是，专利技术人通过在宿主细胞中表达可调制的recE/recT重组系统以及可调制水平的recBCD核酶抑制剂，使得DNA序列与BAC发生同源重组而对BAC进行修饰。表达recBCD核酶抑制剂是为了抑制内源性产生的recBCD核酶的功能活性。另外，调制和协同表达recE/recT同源重组系统和recBCD核酶抑制剂的能力便于控制同源重组事件，并使随机的和不必要的重组事件最小化。调制和协同表达同源重组系统和recBCD核酶抑制剂的能力便于在以下两种情况下在体内诱导同源重组事件，所述情况是身为重组主体的至少一个核酸序列位于F-质粒(如BAC)，或者宿主细胞对过量表达重组系统分子或recBCD抑制剂(如gam)敏感。专利技术简述在整个说明书和其后的权利要求书中，除非上下文需要，否则的话，术语“含有”应被理解成包括所提及的一个整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其它整数或步骤或其它组整数或步骤。说明书中所指的核苷酸和氨基酸序列的序列鉴定号(SEQ ID No.)将在文献目录之后定义。因此，本专利技术提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。另一方面，本专利技术提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD，recE，recT和编码recBCD抑制剂或其功能衍生物的核苷酸序列，recE，recT和编码recBCD抑制剂的核苷酸序列的表达是可调制的。另一方面，本专利技术提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD，recE，recT和本文档来自技高网...

【技术保护点】
便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括：通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达ｒｅｃＢＣＤ和编码外切核酸酶，重组蛋白质和ｒｅｃＢＣＤ抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和ｒｅｃＢＣＤ抑制剂的表达是可调制的。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：P艾欧安诺，K纳拉亚南，
申请(专利权)人：默多克研究所，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]