生物活性分子的制备制造技术

本发明专利技术生物活性分子是从无生物活性的前体产生，通过其天然切割位点突变为能为蛋白酶切割的位点、并切割该突变分子而产生生物活性分子。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总的涉及产生以无活性前体存在的生物活性分子及其在体内被蛋白酶切割而成的成熟的生物活性分子。更具体说，本专利技术涉及产生天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)和细胞因子，即从其相对应的前体通过体内自身切割、其他天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的切割或诸如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(也称为白介素1转化酶ICE)等蛋白酶的切割，产生天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶和细胞因子。以这种方式产生的细胞因子的例子是白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)。
技术介绍
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶是一个丝氨酸蛋白酶家族，它们能在天冬氨酸(ASP)残基之后切割其靶蛋白质。已公布的11种已知天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1，可能还有天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-4，-5和-11似乎主要参与促炎症细胞因子的加工，而其他天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶在引发和导致细胞凋亡或细胞程序死亡中起着关键性作用。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶具有几个共同特征即它们合成时为无催化活性的酶原，一般通过结构域之间连接处中存在的特定内部ASP残基之后的切割而被激活，并能够在ASP残基之后切割其底物。结果，某些成熟的活性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，特别是衍生自长的有前结构域的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，可以加工和激活其自身以及其他无活性的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶原。根据一级结构，可将促细胞凋亡的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶分成二类I类包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2、-8、-9和-10，含有长的氨基末端前结构域；II类如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3、-6和-7，具有短的或没有前结构域。体外切割实验提示，II类天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解加工需要活化的I类天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(12)。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的另一种分类法是根据切割位点的特异性分类(13)。I组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶具有共有序列WEHD(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1，-4和-5)；II组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶共有序列为DExD(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2，-3和-7)，第III组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶共有序列为(IVL)ExD(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-6，-8和-9)，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8最适位点是LETD(14)。白介素18(IL-18)，起初称为β-干扰素(IFN-β)诱导因子，是最近得到鉴定的一种细胞因子，具有与蛋白质IL-1家族相同的结构特征(1-4)，已从用热灭活的痤疮丙酸杆菌(P.acnes)处理、然后用脂多糖(LPS)处理的小鼠肝脏初步纯化，并随后克隆了IL-18(2、5)。最近也报道了人IL-18的克隆(3)。像IL-12一样，IL-18由活化的巨噬细胞，如肝枯否细胞和其他驻留巨噬细胞产生(3)。IL-18是Th1应答反应的一种早期诱导剂，协同刺激产生IFN- 以及TNF-β、粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子和IL-2(6)。此外，它能促进抗CD3诱导的T细胞增殖和通过增强Fas配体的表达提高自然杀伤细胞的细胞毒性(6、7)。不像具有四螺旋束状结构的大多数其他细胞因子，IL-18和IL-1β具有的都是β折叠片层结构门(7)。与IL-1β相似，IL-18合成时也为无生物活性的前体(前IL-18)，缺乏信号肽(3)。IL-1β和IL-18前体经天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(IL-1β转化酶，或ICE)切割，切割发生在P1部位天冬氨酸之后。产生的成熟细胞因子易于从细胞释放(8、9)。用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1缺陷小鼠作的研究证明了成熟IL-18的重要作用是作为IFN-β和Th1应答反应的诱导剂。给这种小鼠注射P.acnes和LPS导致循环IFN-β水平比野生型小鼠为低侣(8、9)。给天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1缺陷小鼠注射IL-18恢复了其LPS诱导的IFN- 水平(9)。这进一步支持了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1参与了激活IL-18产生的观点。其他天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，特别是切割与细胞凋亡相关的胞内蛋白质的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，其活性比天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1至少低100倍(9)。用IL-18缺陷小鼠作的类似研究揭示了它在NK细胞活化和细胞因子诱导中的作用(10)。大肠杆菌表达的重组IL-1β和小鼠IL-18可以重折叠产生活性完全的细胞因子。但尝试在大肠杆菌或其他宿主中表达成熟形式的人IL-18未能产生活性完全的细胞因子。由于其在恶性肿瘤或需要诱导产生β干扰素的病情下的潜在治疗用途，需要建立一种有效的表达系统来产生成熟的有生物活性的人IL-18。专利技术概述本专利技术使得以无生物活性前体形式天然加工形成的分子经切割该前体后成为活性的分子。这在体外不是能容易进行的。本专利技术提供一种从无生物活性的前体产生生物活性分子的方法，该方法是使该分子的天然切割位点突变为对常用蛋白酶切割敏感的位点、并切割该突变分子而产生生物活性分子。优选的该生物活性分子是天冬氨酸物异性半胱氨酸蛋白酶可细胞因子，更优选的是IL-1β和IL-18。在这些细胞因子中，优选的天然切割位点是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的切割位点。用于切割的常用蛋白酶可以选自凝血酶、肠激酶、枯草杆菌蛋白酶、基因酶TM(genenaseTM，New England Biolabs，Beverly MA，USA)、人鼻病毒3C蛋白酶和因子Xa蛋白酶。当用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶切割时，优选天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8。在本专利技术一个较佳实施方式中，该方法包括用含有编码生物活性分子前体(其切割位点已突变)的cDNA的载体转染宿生，培养转染的宿主，表达该前体，以及用蛋白酶处理后分离该生物活性分子。可任选地可以下述方法进行分离，即将cDNA按照读框融合于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码序列，并将表达的融合分子在用蛋白酶处理前捕俘于谷胱甘肽琼脂糖珠上。本专利技术还提供编码生物活性分子的突变前体的cDNA，其可任选地融合于GST编码序列。在本专利技术的一个实施方式中提供一种产生和/或纯化重组杂交多肽或融合蛋白的方法。更具体说，将编码某蛋白分子的DNA片段融合于编码结合性蛋白的DNA片段。可用被天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶能识别和切割的编码肽序列的DNA。作为连接序列，将融合的DNA插入克隆用载体，用其转化适合的宿主。表达后，通过使该杂交肽与配体或底物(该结合性蛋白对此配体或底物具有特异性亲和力)接触而纯化，即通过亲和层析而纯化。在本专利技术的一个较佳实施方式中，该结合性蛋白是GST，切割位点是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8的切割位点。本专利技术还涉及用上述方法制备的生物活性分子。在大肠杆菌中表达成熟的IL-18导致产生缺乏生物活性的蛋白质。正确重折叠大肠杆菌中表达的IL-18多肽骨架的尝试迄今未成功。人IL-18和人IL-1β在体内分别表达为前IL-18(pro IL-18)和前IL-1β(pro IL-1β)前体，须经天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1切割产生生物活性的成熟IL-18和IL-1β。然而天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1不能购到商品。本专利技术提供一种简本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从无生物活性的前体产生生物活性分子的方法，其特征在于，该方法包括将该分子的天然切割位点突变为能被蛋白酶切割的位点，并切割该突变分子以产生生物活性分子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M鲁宾斯坦，刘卞灵，D诺维克，P格雷伯，
申请(专利权)人：依达研究发展有限公司，
类型：发明
国别省市：IL[以色列]