视紫红质‑荧光分子复合体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公布了一种视紫红质‑荧光分子复合体及其制备方法和应用。本发明专利技术将荧光小分子连接到视紫红质的N端或插入视紫红质胞外loop区域中，提供了一种空间灵敏度高、速度快、亮度高，同时具有空间分辨率和细胞特异性的膜蛋白‑荧光分子复合体，并将其作为膜电位荧光探针应用到细胞膜电位和细胞连接检测中。

Rhodopsin fluorescent molecular complex and preparation method and application thereof

The invention discloses a rhodopsin fluorescent molecular complex and preparation method and application thereof. The invention of fluorescent molecules connected to the rhodopsin rhodopsin insertion end N or loop extracellular region, provides a space of high sensitivity, fast speed, high brightness, membrane protein fluorescent molecular complex with spatial resolution and cell specificity, and as a membrane potential fluorescent probe applied to the cell membrane potential and cell junction detection.

【技术实现步骤摘要】
视紫红质-荧光分子复合体及其制备方法和应用
本专利技术涉及膜蛋白与荧光分子复合体，特别涉及一种视紫红质-荧光分子复合体及其制备方法，以及其在膜电位和细胞连接检测中的应用。
技术介绍
膜电位普遍存在于多种多样的细胞中，如神经细胞、心肌细胞、淋巴细胞、癌细胞等。膜电位是细胞生命活动的重要参数和指标，也是重要的调节信号，如神经传递、细胞增殖、细胞分化和迁移等。通过膜电位的检测我们可以监测生物的神经活动、心脏状态以及细胞增值等多种生理活动。对于疾病的诊断具有非常重要的意义。现有的膜电位检测方法主要有电生理、化学染料探针和基因编码的蛋白质荧光探针。电生理通过电极直接记录膜电位，化学染料探针和蛋白质荧光探针通过显微镜读取荧光强度的变化来间接记录膜电位。但是这三种技术都有各自的缺点。比如，电生理检测没有空间分辨率，化学染料探针无法实现细胞特异检测，蛋白质荧光探针存在灵敏度、速度、亮度等多种问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有的技术缺陷，提供一种空间灵敏度高、速度快、亮度高，同时具有空间分辨率和细胞特异性的膜蛋白-荧光分子复合体，并将其作为膜电位荧光探针应用到细胞膜电位和细胞连接检测中。本专利技术提供的膜蛋白-荧光分子复合体中，所述膜蛋白为视紫红质(rhodopsin)，该蛋白为七次跨膜蛋白，胞外有四个区域，所述荧光分子连接在这四个胞外区域中的任一区域上。如图1所示，黑色的平行双杠代表细胞膜，双杠中间区域代表膜间隙，双杠上方区域为胞外区域，双杠下方区域为胞质区域；灰色曲线代表七次跨膜的视紫红质，黑色圆球代表连接在视紫红质N端或者是插入视紫红质胞外loop区域中的多肽序列，黑色星号代表荧光分子。在本专利技术的一些实例中，所述多肽序列是LAP多肽序列，优选为LAP2多肽序列；所述荧光分子可以是AlexaFluor488、AlexaFluor568、AlexaFluor594、Cy3和Cy5中的任意一种，通过带有炔基的化学荧光小分子与含叠氮基的小分子叠氮甲基吡啶(pAz)发生环加成反应共价连接到LAP多肽序列上，具体反应原理可参见图2。第一步，在视紫红质的胞外区域的N端或者胞外loop中加在一段13个氨基酸的LAP多肽序列；第二步，将LplA酶(LAP序列特异的识别酶)以及LplA酶的底物pAz与表达rhodopsin-LAP的细胞进行孵育，此时，LplA会将pAz连接到LAP序列上；第三步，因为pAz是含有叠氮基的小分子，所以可以与含有炔基的分子发生环加成反应，在这一步中将带有炔基的化学荧光小分子与第二步的反应产物孵育，便会形成rhodopsin-LAP-pAz-荧光小分子。在本专利技术的另一些实例中，所述多肽序列是AP多肽序列；所述荧光分子选自cy3、Alex-488、Alex-568、Alex-594和cy5中的任意一种，可以通过链霉亲和素(streptavidin)与生物素(biotin)之间的结合作用与AP多肽序列连接起来。首先在视紫红质的胞外区域(N端或者胞外loop中)插入一个15个氨基酸的AP多肽序列，该序列可以被BirA酶识别，BirA会把生物素连接到AP序列上，然后将连接了荧光小分子的链霉亲和素与细胞表达的rhodopsin-AP-biotin孵育，通过链霉亲和素与生物素的结合，荧光小分子便可以被连接到视紫红质上面。在本专利技术的另一些实例中，所述多肽序列是Halotag蛋白标签，所述荧光分子选自cy3、Alex-488、Alex-568、Alex-594和cy5中的任意一种。首先在视紫红质的胞外区域插入一个Halotag标签蛋白，然后将荧光小分子与细胞表达的rhodopsin-Halotag孵育，得到结构为rhodopsin-Halotag-荧光小分子的复合体。在本专利技术的另一些实例中，所述多肽序列是SNAPtag蛋白标签，所述荧光分子选自cy3、Alex-488、Alex-568、Alex-594和cy5中的任意一种。首先在视紫红质的胞外区域插入一个SNAPtag标签蛋白，然后将荧光小分子与细胞表达的rhodopsin-SNAPtag孵育，得到结构为rhodopsin-SNAPtag-荧光小分子的复合体。本专利技术提供的视紫红质-荧光分子复合体的制备方法包括以下步骤：1)构建含有视紫红质-多肽序列融合蛋白基因的表达载体，所述融合蛋白中多肽序列连接在视紫红质N端或者插入到视紫红质胞外任一loop区域中；2)将步骤1)构建的表达载体转入细胞中进行表达；3)对表达所述视紫红质-多肽序列融合蛋白的细胞进行荧光分子标记，得到视紫红质-荧光分子复合体。在“视紫红质-LAP-荧光小分子”复合体的制备中，步骤1)通过分子克隆技术将LAP多肽插入视紫红质胞外区域中，并将该视紫红质-LAP融合蛋白基因构建在表达载体上；步骤2)将表达载体转入细胞中进行表达；步骤3)将LplA酶、底物叠氮甲基吡啶(pAz)与表达视紫红质-LAP融合蛋白的细胞进行孵育，使picolylazide连接到LAP多肽上，然后洗去残留试剂，再向细胞中加入含有炔基的荧光小分子AlexaFluor488、AlexaFluor568、AlexaFluor594、Cy3和Cy5中的任意一种进行孵育，使荧光分子与pAz发生环加成反应，形成“视紫红质-LAP-荧光小分子”复合体。在“视紫红质-AP-荧光小分子”复合体的制备中，步骤1)通过分子克隆技术将AP多肽插入视紫红质胞外区域中，并将该视紫红质-AP融合蛋白基因构建在表达载体上；步骤2)将视紫红质-AP融合蛋白表达载体和ER腔定位的BirA生物素连接酶表达载体共同转入细胞中进行表达，并在细胞培养基中添加生物素；步骤3)向表达视紫红质-AP融合蛋白的细胞添加链酶亲和素连接的荧光小分子AlexaFluor488、AlexaFluor568、AlexaFluor594、Cy3和Cy5中的任意一种，得到“视紫红质-AP-荧光小分子”复合体。其中，步骤2)视紫红质-AP融合蛋白表达载体和BirA生物素连接酶表达载体共转染时，两种表达载体的质量比优选为1:1。在“视紫红质-Halotag-荧光小分子”复合体的制备中，步骤1)通过分子克隆技术将Halotag连接到视紫红质蛋白的N端，并将该视紫红质-Halotag融合蛋白基因构建在表达载体上；步骤2)将视紫红质-Halotag融合蛋白表达载体转入细胞中进行表达；步骤3)向表达视紫红质-Halotag融合蛋白的细胞添加荧光小分子AlexaFluor488、AlexaFluor568、AlexaFluor594、Cy3和Cy5中的任意一种，得到“视紫红质-Halotag-荧光小分子”复合体。在“视紫红质-SNAPtag-荧光小分子”复合体的制备中，步骤1)通过分子克隆技术将SNAPtag连接到视紫红质蛋白的N端，并将该视紫红质-SNAPtag融合蛋白基因构建在表达载体上；步骤2)将视紫红质-SNAPtag融合蛋白表达载体转入细胞中进行表达；步骤3)向表达视紫红质-SNAPtag融合蛋白的细胞添加荧光小分子AlexaFluor488、AlexaFluor568、AlexaFluor594、Cy3和Cy5中的任意一种，得到“视紫红质-SNAPtag-荧光小分子”复合体。上述制备方法中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种膜蛋白‑荧光分子复合体，其中：所述膜蛋白为视紫红质，该蛋白为七次跨膜蛋白，胞外有四个区域，所述荧光分子连接在这四个胞外区域中的任一区域上。

【技术特征摘要】
1.一种膜蛋白-荧光分子复合体，其中：所述膜蛋白为视紫红质，该蛋白为七次跨膜蛋白，胞外有四个区域，所述荧光分子连接在这四个胞外区域中的任一区域上。2.如权利要求1所述的膜蛋白-荧光分子复合体，其特征在于，在视紫红质的N端或者胞外任一loop区域中连接有一多肽序列，所述荧光分子与该多肽序列连接。3.如权利要求2所述的膜蛋白-荧光分子复合体，其特征在于，所述多肽序列是LAP多肽序列，所述荧光分子选自AlexaFluor488、AlexaFluor568、AlexaFluor594、Cy3和Cy5中的任意一种；所述荧光分子由小分子叠氮甲基吡啶介导，通过炔基与叠氮甲基吡啶的叠氮基发生环加成反应共价连接到LAP多肽序列上。4.如权利要求2所述的膜蛋白-荧光分子复合体，其特征在于，所述多肽序列是AP多肽序列，所述荧光分子选自AlexaFluor488、AlexaFluor568、AlexaFluor594、Cy3和Cy5中的任意一种；AP多肽序列连接生物素，荧光分子通过链霉亲和素与生物素之间的结合作用连接到AP多肽序列上。5.如权利要求2所述的膜蛋白-荧光分子复合体，其特征在于，所述多肽序列是Halotag蛋白标签或SNAPtag蛋白标签，所述荧光分子选自AlexaFluor488、AlexaFluor568、AlexaFluor594、Cy3和Cy5中的任意一种。6.权利要求1所述膜蛋白-荧光分子复合体的制备方法，包括以下步骤：1)构建含有视紫红质-多肽序列融合蛋白基因的表达载体，所述融合蛋白中多肽序列连接在视紫红质N端或者插入到视紫红质胞外任一loop区域中；2)将步骤1)构建的表达载体转入细胞中进行表达；3)对表达所述视紫红质-多肽序列融合蛋白的细胞进行荧光分子标记，得到视紫红质-荧光分子复合体。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)将LAP多肽插入...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹鹏，胥永显，王思聪，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11