一种从发酵液中提取纯化透明质酸的方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵技术领域，涉及一种从发酵液中提取纯化透明质酸的方法，其包括了以下步骤：步骤1)发酵液稀释离心取上清液，步骤2)调至适宜pH后加入高锰酸钾溶液反应，步骤3)加入活性炭吸附，步骤4)抽滤取滤液，步骤5)超滤取截留液，步骤6)用乙醇进行沉淀，步骤7)洗涤沉淀后进行真空干燥。本发明专利技术提取方法具有收率高，操作简便，费用低廉，对环境无污染等优点。

A method for extraction and purification of hyaluronic acid from fermentation broth

【技术实现步骤摘要】
一种从发酵液中提取纯化透明质酸的方法
本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种从发酵液中提取纯化透明质酸的方法
技术介绍
透明质酸(hyaluronicacid，HA)是由葡萄糖醛酸与N-乙酰氨基葡萄糖分别以β-1,3和β-1,4糖苷键重复交替连接而成的具有直链结构的生物聚合体。不同来源的透明质酸的聚合度即分子量有显著差异，分子量范围从104到107Da。在动物机体内，透明质酸通常以透明质酸盐形式存在，并且皮肤、脐带和眼玻璃体中透明质酸浓度较高。另外，透明质酸也存在于少数微生物种属如A组和C组链球菌中。透明质酸具有独特的分子结构和流变学特性以及重要的生理学功能。由于具备优良的保湿保水性能和粘弹特性，以及无免疫原性和毒性，透明质酸被广泛应用于化妆品、生物医药和食品行业等领域。采用微生物发酵发生产透明质酸，大大拓宽了HA的来源。微生物发酵生产HA不仅降低了HA的生产成本，而且具有较高的质量和良好的品质。从发酵液提取HA的工艺过程会直接影响着HA的产量和生产成本。由于透明质酸发酵液的高粘性度，且含有大量的菌体蛋白、核酸、色素、金属离子及其他杂质，需要通过不同的方法分离纯化HA。这样使提取纯化存在一定难度，产品纯度不高等问题，需要对提取纯化技术进行优化。以往的HA提取方法普遍存在着成本高、提取率不高、质量低劣和品质不稳定、环境污染等缺点，难以适应工业化生产和实际应用的需要。活性炭吸附是一种常用的方法，可以有效除去发酵液中的色素、杂蛋白，从而提高HA的品质。如公开号为CN105859911A公开的《一种透明质酸分离纯化的方法》单独采用1％-10％(w/v)的活性炭吸附脱色，不仅使用的活性炭多，且脱炭效果差，会堵塞超滤膜膜孔。如公开号为103304684A公开的《一种提取纯化透明质酸的生产方法》中，没有经过浓缩脱水即进行醇沉，会大大增加乙醇的用量，造成浪费和环境污染等问题。
技术实现思路
为克服以上问题，本专利技术提供了一种从发酵液中提取纯化透明质酸的方法，不仅可以很好地与菌体分离，除去蛋白质、色素、金属离子等杂质，而且解决了成本高、收率低、质量低劣、环境污染等问题，使产品质量更稳定，使其更广泛地应用到医药、化妆品领域。本专利技术为解决上述问题提出的技术方案：一种从发酵液中提取纯化透明质酸的方法，其特征在于，采用如下步骤：步骤1)将发酵液稀释5倍，4000rpm/min离心20min，取上清液；步骤2)将步骤1)所得的上清液的pH调至3.5-4.5，加入1％高锰酸钾(w/v)，用水浴加热至40-50℃，搅拌进行氧化反应0.5-1h；步骤3)加入活性炭，投入活性炭的量与高锰酸钾的比例不得少于2:1，继续在40-50℃水浴中搅拌，反应0.5-1h；步骤4)趁热抽滤步骤5)超滤浓缩步骤4)所得的澄清滤液，超滤过程中用纯水进行冲洗步骤6)在步骤5)中得到的截留液中加入3％(w/v)氯化钠，加入2-3倍无水乙醇进行沉淀，放置一夜步骤7)用无水乙醇多次洗涤步骤6)中得到的絮状沉淀，真空干燥，干燥温度为40-60℃。本专利技术的有益效果：本专利技术所用的稀释离心除菌体，不仅菌体除去的彻底，而且操作简单，对透明质酸的分子量没有降解的副作用。采用高锰酸钾和活性炭的结合脱色、去除蛋白质，色素去除效果明显，且操作简单。运用超滤，去除残留的小分子蛋白，重金属离子，从发酵液中制备透明质酸钠的操作工序，不仅在实验室中使用方便，而且进行工业化生产。具体实施方式以下通过具体实施例来进一步说明本专利技术，具体细节仅用于解释本专利技术，但专利技术并不受限于下列实施例。实施例1一种从发酵液中提取纯化透明质酸的方法，其包括如下步骤：步骤1)取1L发酵液，加入纯水，稀释至5倍，4000rpm离心20min，取上清液；步骤2)将所得上清液的pH调至4.0，加入0.1％(w/v)高锰酸钾，放入50℃水浴锅中，搅拌0.5h；步骤3)加入0.2％(w/v)活性炭，继续在50℃水浴中搅拌，反应1h；步骤4)将珍珠岩先抽成预铺层，进行抽滤；步骤5)抽滤所得的澄清液体，倒入超滤装置中进行超滤浓缩，超滤膜截留的分子量为20000MW，超滤过程中用纯水进行冲洗；步骤6)在超滤所得的截留液中加入3％氯化钠搅拌溶解后，加入2倍体积的无水乙醇，要注意缓缓加入，且不停地搅拌；步骤7)得到的沉淀静置12h后，再用无水乙醇多次洗涤，得到的白色絮状沉淀，放入真空干燥器，干燥温度为50℃，干燥时间为8h。检测结果：提取收率为90.8％，蛋白质含量为0.018，蛋白质除去率为94％。实施例2步骤1)取500ml发酵液，加入纯水，稀释至10倍，倒入陶瓷膜中过滤，膜孔径为200nm，取滤液；步骤2)在滤液中，加入1％活性炭，搅拌1h；步骤3)在布氏漏斗上垫3层滤纸，铺好珍珠岩预铺层后，抽滤至澄清；步骤4)将滤液倒入超滤装置中，进行超滤，膜孔径为20000MW，并用纯水冲洗，取截留液；步骤5)截留液中加入3％的氯化钠，溶解后加入2倍体积的无水乙醇，边搅拌边得到絮状沉淀；步骤6)静置12h后，用无水乙醇多次洗涤沉淀，放入真空干燥器中进行干燥，干燥6h。检测结果：提取收率为65.1％，蛋白质含量为0.078％，蛋白质除去率为91％。实施例3步骤1)取1L发酵液，稀释至10倍，加入3％的珍珠岩，进行板框过滤；步骤2)取步骤1)中得到的滤液，导入超滤装置中，进行超滤，膜孔径为20000MW，并用纯水冲洗，取截留液；步骤3)截留液中加入3％的氯化钠，溶解后加入2倍体积的无水乙醇，边搅拌边得到絮状沉淀；步骤4)静置12h后，用无水乙醇多次洗涤沉淀，放入真空干燥器中进行干燥，干燥6h。检测结果：提取收率为72.3％，蛋白质含量为0.086％，蛋白质除去率为86％。最后应当说明的是，以上实施例进用于说明本专利技术的技术方面而非对本专利技术保护范围的限制，本领域的技术人员应当理解，可以对本专利技术的技术方案进行适当修改或者等同替换，但不能脱离本专利技术技术方案的实质和范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从发酵液中提取纯化透明质酸的方法，其包括如下步骤：步骤1)发酵液稀释离心取上清液，步骤2)调至适宜pH后加入高锰酸钾溶液反应，步骤3)加入活性炭吸附，步骤4)抽滤取滤液，步骤5)超滤取截留液，步骤6)用乙醇进行沉淀，步骤7)洗涤沉淀后进行真空干燥。

【技术特征摘要】
1.一种从发酵液中提取纯化透明质酸的方法，其包括如下步骤：步骤1)发酵液稀释离心取上清液，步骤2)调至适宜pH后加入高锰酸钾溶液反应，步骤3)加入活性炭吸附，步骤4)抽滤取滤液，步骤5)超滤取截留液，步骤6)用乙醇进行沉淀，步骤7)洗涤沉淀后进行真空干燥。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取纯化方法包括如下步骤：步骤1)将发酵液稀释4-6倍，离心取上清液；步骤2)将步骤1)所得的上清液的pH调至3.5-4.5，加入高锰酸钾，用水浴加热至40-50℃，搅拌进行氧化反应0.5-1h；步骤3)加入活性炭，投入活性炭的量与高锰酸钾的比例不得少于2:1，继续在40-50℃水浴中搅拌，反应0.5-1h；步骤4)趁热抽滤；步骤5)超滤浓缩步骤4)所得的澄清滤液，超滤过程中用纯水进...

【专利技术属性】
技术研发人员：金梦园，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33