一种白术内酯V、制备方法和在CIK细胞冻存方面的应用技术

本发明专利技术公开了一种白术内酯V、制备方法和在CIK细胞冻存方面的应用。本发明专利技术发现了一种新的白术内酯衍生物，与白术内酯Ⅱ是同分异构体，为白术内酯Ⅲ的另一种脱水产物，命名为白术内酯V；本发明专利技术提供了一种高效大量制备白术内酯V的方法，包括如下步骤：步骤S1，加酸腐化；步骤S2，乙醇提取；步骤S3，大孔树脂富集；步骤S4，高速逆流色谱纯化；该方法不需要反复使用硅胶柱层析，易于工业化大生产；本发明专利技术发现白术内酯V对冻存的CIK细胞具有保护作用，可以用于CIK细胞冻存。本发明专利技术还提供了白术内酯V的储存方法：从收集到白术内酯V对应的流份起计时，72小时内将流份浓缩干燥并于‑80℃冷冻保存。

A type of atractylode V, preparation method and application in CIK cell culture

【技术实现步骤摘要】
一种白术内酯V、制备方法和在CIK细胞培养方面的应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及天然产物的发现、制备和应用，具体涉及一种白术内酯V、制备方法和在CIK细胞培养方面的应用。
技术介绍
白术内酯类成分为白术的主要有效成分，目前已发现如下结构的白术内酯：申请人在研究制备白术内酯Ⅱ的高效制备方法时，意外发现一种与白术内酯Ⅱ结构和极性非常接近的内酯化合物，经鉴定为白术内酯Ⅲ的另一种脱水产物，命名为白术内酯V，通过高速逆流色谱将其与白术内酯Ⅱ有效分开，纯度大于98％(即专利申请2017109869552中的色谱峰X，如图1A所示)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种白术内酯V、制备方法和在CIK细胞培养方面的应用。实现本专利技术上述目的技术方案如下：如下化学结构的白术内酯V：优选地，所述白术内酯V的制备方法包括如下步骤：步骤S1，加酸腐化：白术粉碎，边翻动边喷稀盐酸，待药粉湿润后于50-60℃堆置过夜；步骤S2，乙醇提取：用体积百分浓度为60-90％的乙醇溶液提取上述腐化的药粉，收集提取液，回收提取液中的乙醇，得浓缩液；步骤S3，大孔树脂富集：将上述浓缩液加水稀释，调节pH值至5.2-6.4，上样于XDA-6大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为25％、45％、65％、85％的乙醇溶液各洗脱6-10个柱体积，收集85％乙醇洗脱液，浓缩；步骤S4，高速逆流色谱纯化：以水-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-三氟乙酸(7:4:1:3：0.05，V/V)为两相溶剂系统对步骤S3所的浓缩物进行高速逆流色谱纯化，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min；根据色谱图收集白术内酯V对应的流份，浓缩干燥，冷冻保存。优选地，所述稀盐酸浓度为0.2-0.4mol/L。优选地，提取用的乙醇浓度优选75％。优选地，提取方式为冷浸或热回流或渗漉。优选地，大孔树脂上样液的制备方法为：将步骤S2浓缩液加水稀释至密度为2-3g/mL，过滤，滤液用盐酸调节pH值至5.8。优选地，步骤S4高速逆流色谱柱温为25℃。优选地，步骤S4高速逆流色谱检测波长276nm。优选地，步骤S4从收集到白术内酯V对应的流份起计时，72小时内将流份浓缩干燥并于-80℃冷冻保存。上述白术内酯V用于CIK细胞冻存的用途。本专利技术的突出优点：1、本专利技术发现了一种新的白术内酯衍生物，与白术内酯Ⅱ是同分异构体，为白术内酯Ⅲ的另一种脱水产物，命名为白术内酯V；2、本专利技术提供了一种高效大量制备白术内酯V的方法，且该方法不需要反复使用硅胶柱层析，易于工业化大生产；3、本专利技术发现白术内酯V对冻存的CIK细胞具有保护作用，可以用于CIK细胞冻存。附图说明图1为高速逆流色谱分离色谱图。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本专利技术的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。实施例1白术内酯V的制备一、实验仪器TBE-300A高速逆流色谱仪，中国上海同田生化技术有限公司：配有TBE-2000紫外检测器(聚四氟乙烯柱，内径1.6mm，柱容积280mL)，TBP-50泵。XDA-6大孔吸附树脂购于郑州勤实科技有限公司。二、实验方法和结果一种白术内酯V的制备方法，包括如下步骤：步骤S1，加酸腐化：白术粉碎过40目筛，边翻动边喷稀盐酸，稀盐酸浓度为0.3mol/L，待药粉湿润后于55℃堆置过夜；步骤S2，乙醇提取：用体积百分浓度为75％的乙醇溶液提取上述腐化的药粉，固液比为1:40，提取方式为冷浸48h，收集提取液，回收提取液中的乙醇，得浓缩液；步骤S3，大孔树脂富集：将上述浓缩液加水稀释至密度为2.5g/mL，调节pH值至5.8，上样于XDA-6大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为25％、45％、65％、85％的乙醇溶液各洗脱8个柱体积，收集85％乙醇洗脱液，浓缩至干；步骤S4，高速逆流色谱纯化：以水-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-三氟乙酸(7:4:1:3：0.05，V/V)为两相溶剂系统对步骤S3所的浓缩物进行高速逆流色谱纯化，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min；根据色谱图收集白术内酯V对应的流份，浓缩干燥，冷冻保存。高速逆流分离具体如下：按水-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-三氟乙酸(7:4:1:3：0.05，V/V)配制溶剂体系，静置过夜后两相分离，超声脱气30min。上相作固定相，下相作流动相。将固定相以20mL/min的流速泵满管路，再以850rpm正转，流速2mL/min的条件泵入流动相，温度25℃，检测波长276nm。有下相流出时体系平衡，取步骤S3制备的干粉200mg用15mL下相溶解、进样。根据色谱流出图对组分出峰部位进行收集，色谱图如图1A所示，获得白术内酯V(纯度＞98％)。上述高速逆流色谱条件溶剂体系中的三氟乙酸对分离效果至关重要。申请人起初没有添加三氟乙酸，得到的色谱图如图1B所示，色谱峰M为白术内酯Ⅱ和白术内酯V的共洗脱色谱峰，最终通过进一步优化将色谱峰M分开成了图1A中的白术内酯Ⅱ色谱峰和白术内酯V色谱峰(即申请2017109869552中的色谱峰X)。白术内酯V的鉴定：无色针晶，mp101-102℃(石油醚)。HRMS测得[M+H]+为231.2928，分子式为C15H18O2。核磁鉴定数据13C-NMR(CDCl3,500MHz)如下表(与白术内酯Ⅱ对比)：根据上述鉴定数据及与文献相关化合物的对比，确定白术内酯V化学结构如上。实施例2一种白术内酯V的制备方法，包括如下步骤：步骤S1，加酸腐化：白术粉碎过40目筛，边翻动边喷稀盐酸，稀盐酸浓度为0.2mol/L，待药粉湿润后于60℃堆置过夜；步骤S2，乙醇提取：用体积百分浓度为60％的乙醇溶液提取上述腐化的药粉，固液比为1:40，提取方式为冷浸48h，收集提取液，回收提取液中的乙醇，得浓缩液；步骤S3，大孔树脂富集：将上述浓缩液加水稀释至密度为2.5g/mL，调节pH值至5.2，上样于XDA-6大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为25％、45％、65％、85％的乙醇溶液各洗脱6个柱体积，收集85％乙醇洗脱液，浓缩至干；步骤S4，高速逆流色谱纯化：以水-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-三氟乙酸(7:4:1:3：0.05，V/V)为两相溶剂系统对步骤S3所的浓缩物进行高速逆流色谱纯化，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min，柱温为25℃，检测波长276nm；根据色谱图收集白术内酯V对应的流份，浓缩干燥即得纯度大于98％的白术内酯V。实施例3一种白术内酯V的制备方法，包括如下步骤：步骤S1，加酸腐化：白术粉碎过40目筛，边翻动边喷稀盐酸，稀盐酸浓度为0.4mol/L，待药粉湿润后于50℃堆置过夜；步骤S2，乙醇提取：用体积百分浓度为90％的乙醇溶液提取上述腐化的药粉，固液比为1:40，提取方式为冷浸48h，收集提取液，回收提取液中的乙醇，得浓缩液；步骤S3，大孔树脂富集：将上述浓缩液加水稀释至密度为2.5g/mL，调节pH值至6.4，上样于XDA-6大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为25％、45％、65％、85％的乙醇溶液各洗脱10个柱体积，收集85％乙醇洗脱液，浓缩至干；步骤S4，高速逆流色谱纯化：以水-正丁醇-甲基叔丁基醚-本文档来自技高网...

【技术保护点】
如下化学结构的白术内酯V：

【技术特征摘要】
1.如下化学结构的白术内酯V：2.权利要求1所述白术内酯V的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，加酸腐化：白术粉碎，边翻动边喷稀盐酸，待药粉湿润后于50-60℃堆置过夜；步骤S2，乙醇提取：用体积百分浓度为60-90％的乙醇溶液提取上述腐化的药粉，收集提取液，回收提取液中的乙醇，得浓缩液；步骤S3，大孔树脂富集：将上述浓缩液加水稀释，调节pH值至5.2-6.4，上样于XDA-6大孔吸附树脂，依次用体积百分浓度为25％、45％、65％、85％的乙醇溶液各洗脱6-10个柱体积，收集85％乙醇洗脱液，浓缩；步骤S4，高速逆流色谱纯化：以水-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-三氟乙酸(7:4:1:3：0.05，V/V)为两相溶剂系统对步骤S3所的浓缩物进行高速逆流色谱纯化，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0mL/min；根据色谱图收集白术内酯V对应的流份，浓缩...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莉，张艳峰，徐梦龙，
申请(专利权)人：南京盖斯夫医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32