白细胞介素-15基因修饰的自然杀伤细胞株及其制备方法技术

白细胞介素－１５基因修饰的自然杀伤细胞株，其表型为ＣＤ５６强阳性，ＣＤ１６和ＣＤ３均为阴性，其特征在于形态为分散的、半贴壁生长状态。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞过继免疫治疗肿瘤领域，更具体地，本专利技术涉及基因修饰的自然杀伤细胞株及其制备方法。二.技术背景自然杀伤(natural killer，NK)细胞在机体抗肿瘤、抗病毒过程中起着重要作用。以往是从人外周血中分离NK细胞用于临床治疗，但是，NK细胞的分离、纯化以及体外培养存在技术难度。因此，本领域需要一种在体外培养方便、生长快速、对肿瘤细胞杀伤活性高，使用效率高，毒副作用低的NK细胞株。其中，NK-92细胞是从非何杰金氏淋巴瘤病人建立的一种具有高效广谱抗肿瘤作用的NK细胞系，具有良好的临床应用前景(GongJH，et al.Leukemia，1994，8652；Tam YK，et al.J Heamatother，1999，8281)。但NK-92细胞的增殖和生物学活性依赖于白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，在临床应用时，有些情况下需要注射IL-2。可是，由于IL-2的毒副作用使得NK-92在临床应用中受到一定程度的限制。为了解决这一缺陷，Nagashima S和Tam YK根据NK-92对IL-2的依赖性先后将IL-2基因转染入NK-92细胞，获得了非IL-2依赖的NK细胞株(Nagashima S，et al.Blood，1998，913850；Tam YK，et al.Human Gene Therapy，1999，101359)。虽然Nagashima S和Tam YK等人所获得IL-2基因修饰的NK细胞株克服了对IL-2的依赖性、在临床应用时不需要注射IL-2，但是，其生物学特性与未修饰的NK细胞具有相似性，而且自身会分泌一定剂量的IL-2，仍有潜在的不利因素，没有达到理想的要求。三.
技术实现思路
1.技术问题本专利技术的目的是提供一种利用IL-15基因修饰的NK细胞株及其制备方法，以改变NK细胞的生物学特性，提高增殖和杀伤能力，使NK细胞更适于临床应用。2.技术方案IL-15基因修饰的NK细胞株，其表型为CD56强阳性，CD16和CD3均为阴性，其特征是形态为分散的半贴壁生长状态。在此基础上，NK细胞杀伤的必须黏附分子CD54的表达率达到90～100％，平均荧光强度达到220。与NK细胞增殖相关的细胞膜表面分子CD25的表达率达到50～80％。与NK细胞活化相关的细胞膜表面分子CD69的表达率达到15～65％。与NK细胞活化相关的细胞膜表面分子CD48的平均荧光强度达到435。制备上述细胞株的方法为将IL-15的cDNA编码区插入pcDNA3真核表达载体，构建分泌型重组真核表达载体pcDNA3/IL-15；利用脂质体转染NK-92细胞；在筛选培养基中加入Geneticin(G418)进行筛选；有限稀释克隆化细胞，以IL-15的依赖细胞株测定克隆细胞培养上清中IL-15的活性，从中挑选出表达IL-15的阳性细胞克隆；将该克隆在含10％小牛血清、8～12.5％马血清、20～100活性单位的IL-15的α-MEM培养基中进行扩增，得到具有临床应用价值的工程细胞株。也就是说，本专利技术从NK细胞分化发育过程中起调节作用的细胞因子入手，一方面考虑到白细胞介素-15(IL-15)在体内多种组织中都有表达，对NK细胞的分化发育过程起着重要作用；另一方面，因为NK-92细胞是未分化成熟的NK细胞，细胞表面能够表达IL-15受体。而且IL-15的毒副作用比IL-2的小得多。所以，本专利技术采用IL-15的分泌型重组真核表达载体转染NK-92细胞，以期获得表达IL-15的NK细胞，通过IL-15自分泌环路，提高NK细胞的增殖能力、对肿瘤细胞的杀伤活性以及NK细胞的使用效率，明显降低毒副作用，更适用于临床应用。所获得的IL-15基因修饰的NK细胞株其表型依然为CD56强阳性、CD16和CD3均为阴性，而形态由修饰前的聚团生长改变为分散的、半贴壁生长状态，更加有利于NK细胞的生长以及对靶细胞的杀伤。而且，NK细胞杀伤的必须黏附分子CD54、与NK细胞增殖相关的细胞膜表面分子CD25、与NK细胞活化相关的细胞膜表面分子CD69和CD48的表达率或平均荧光强度都有显著程度的提高。所述的平均荧光强度是指利用流式细胞术检测的细胞膜表面分子的密度。在制备过程中所使用的脂质体的种类不受限制。所述的IL-15的依赖细胞株是指一种依赖IL-15生长的细胞株CTLL-2。所获得的工程细胞株经过常规的体外扩增就可进行临床应用。关于IL-15基因修饰的NK细胞株的保藏信息目前，该细胞株已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏登记编号为CGMCC No.0996，分类命名为人自然杀伤细胞系，保藏期限为2003.8.27起的三十年。3.有益效果本专利技术一方面提供了一种新的IL-15基因修饰的NK细胞株(NK-92/IL-15)，与未修饰NK-92细胞相比，该细胞株可以稳定表达IL-15；可以在低剂量的IL-15培养条件下拥有高水平的增殖能力，有利于大规模培养；在低剂量IL-15培养条件下，对多种来源的肿瘤细胞的杀伤能力显著提高，提高使用效率，在达到同等抗肿瘤效果的前提下，减少NK细胞的剂量，从而降低成本，更适于临床用于过继免疫治疗肿瘤。四.附图说明图1是人IL-15cDNA的PCR产物的电泳图谱，其中泳道1为IL-15的PCR产物，泳道2为DNA Marker；图2是pcDNA3/IL-15重组质粒的构建流程图；图3是pcDNA3/IL-15稳定转染NK-92细胞示意图；图4是RT-PCR检测NK细胞IL-15mRNA转录水平，其中泳道1为DNA Marker，泳道2为NK-92/IL-15细胞中IL-15mRNA水平，泳道3为NK-92细胞中IL-15mRNA水平；图5是基因修饰前后细胞形态的比较，其中A为修饰前NK-92细胞形态，B为修饰后NK-92/IL-15细胞形态；图6是NK-92/IL-15增殖效应与NK-92细胞的比较，其中A为100U/ml IL-15培养条件下细胞增值趋势，B为25U/ml IL-15培养条件细胞增值趋势；图7是NK-92/IL-15对多种来源肿瘤细胞杀伤活性与NK-92细胞的比较，其中A是对结肠癌HT-29细胞的杀伤活性，B是对高转移肺癌PG5细胞的杀伤活性，C是对喉癌细胞Hep2的杀伤活性，D是对子宫颈癌细胞Hela的杀伤活性，E是对卵巢癌细胞3AO的杀伤活性；图8是NK-92/IL-15细胞相关杀伤分子转录水平与NK-92细胞的比较；图9是NK-92/IL-15细胞CD25分子表达水平与NK-92细胞的比较；图10是NK-92/IL-15细胞CD48分子表达水平与NK-92细胞的比较；图11是NK-92/IL-15细胞CD69分子表达水平与NK-92细胞的比较； 图12是NK-92/IL-15细胞CD54分子表达水平与NK-92细胞的比较。五.具体实施例方式实施例一、pcDNA3/IL-15重组质粒的构建将外周血单个核细胞刺激后提取总RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，扩增人IL-15的cDNA片段，预计长度为486bp(图1)，其中RT参数为37℃1小时，95℃10分钟；PCR参数为94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，循环本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田志刚，张建，魏海明，张建华，孙汭，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，山东省医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：