用于治疗细菌感染的多价噬菌体制备方法技术

提供了噬菌体的复价株系、获得这些株系的方法及其在治疗细菌感染中的应用，特别是针对那些抗药性菌株，尤其是发生于粘稠物阻塞症患者中的。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及噬菌体的复价株系、获得这些株系的方法及其在治疗细菌感染中的应用，特别是在那些有药物抗性的细菌株系感染中的应用。
技术介绍
噬菌体(phages)是一种多样性的病毒，其生活史专一地与细菌细胞相关。噬菌体特征在于溶原性的或裂解性的生活史。作为抗菌剂，裂解性噬菌体尤其有用，该噬菌体当感染对它们敏感的细菌细胞后可在该细胞中复制，从而导致该细胞的完全破坏(通过裂解作用)及新噬菌体的释放，新的噬菌体可攻击和破坏其他的细菌细胞。该过程可发生于体外或体内。噬菌体的一个基本特征是其裂解活性的众所周知的高特异性。该特性可应用于如各种细菌的物种确定(噬菌体分类)(参见如专利说明GB 2285684、US 5824468和SU 543260以及国际专利通知WO 0100786和WO 0109370)。噬菌体的其他已知的应用包括其作为分子生物学工具的应用，如在特定的蛋白质的表达和选择中的应用(如专利描述US6027930)和在灭菌和清除培养基中的应用(如专利描述EP 0414304、EP 0290295和GB 2253859以及国际专利通知WO 9808944和WO9003122)。修饰的噬菌体用于疫苗的生产(如WO 9505454)。也使用了某些噬菌体来源的蛋白质(如EP 0510907、US 5470573、WO9607329)。分离噬菌体和获得噬菌体制备物的方法是众所周知的且经常进行完善(如GB 829266、CS 192212、RU 2109055)。第二次世界大战后在Georgia的Tbilisi微生物学和病毒学研究所(Institute of Microbiology and Virology of Tbilisi)已大规模地应用了噬菌体治疗。那里在细菌感染的治疗和预防中应用了各种噬菌体制备物的储备。可用的数据显示噬菌体治疗的巨大有效性。相似的研究在波兰已进行了超过25年。在弗罗茨瓦夫的波兰科学院免疫学和试验治疗研究所的噬菌体实验室(Bacteriophage Laboratoryof the Institute of Immunology and Experimental Therapy of thePolish Academy of Sciences in Wroclaw)，将噬菌体治疗用于治疗由抗药形式的细菌和那些不对抗生素易感的细菌所导致的感染(参见Stefan lopek等人，Archivum Immunologiae et TherapiaeExperimentalis，1981，31，293；Stefan 等人，ArchivumImmunologiae et Therapiae Experimentalis，1983，31，267；Stefan 等人，Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis，1984，32，317；Stefan 等人，Archivum Immunologiae etTherapiae Experimentalis，1985，33，219；Stefan 等人，Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis，1985，33，241Stefan 等人，Archivum Immunologiae et TherapiaeExperimentalis，1987，35，569；Beata Weber-Dabrowska等人，Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis，2000，48，31-37；Beata Weber-Dabrowska等人，Archivum Immunologiae etTherapiae Experimentalis，2000，48，547-551)。过去14年中在那里进行的噬菌体治疗显示噬菌体治疗的高效性，该治疗包括1473个具有不同组织和器官化脓性感染的患者。在1289个病例中记录到疾病症状的完全消除和康复。必须强调的是在至少一打左右的病例中，噬菌体治疗呈现为消除致命性感染的唯一可能。进行的治疗涉及单独的患者。它由以下内容组成a)从获自患者的材料中分离的细菌株系的生长和鉴定，b)确定该株系对特定噬菌体的易感性及选择对该株系显示最高裂解活性的噬菌体，c)制备具有大量噬菌体颗粒的噬菌体溶菌产物，d)生产用于治疗的无菌噬菌体制备物。该程序相当昂贵、费力且费时。有时，从获得研究材料起到获得用于治疗的完成的无菌噬菌体制备物要经过7-10天。这种延迟在某些疾病状况中太长。大规模的噬菌体治疗不能用目前采用的程序进行。伴随粘稠物阻塞症的感染呈现为一个特别的问题。这是一种遗传的全身疾病，该疾病由粘液分泌腺的功能异常构成，这使得患者倾向于患慢性支气管和肺病。分泌的粘液浓且粘，从而使其难由天然途径(咳嗽)清除。粘液在支气管中的累积和滞留以及在其清除中的损害造成了细菌感染的有利环境，从而导致慢性支气管炎和肺炎。导致伴随粘稠物阻塞症感染的最危险的病原体是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和假单胞菌属(Pseudomonas)的杆菌。这些微生物持久地复发感染导致呼吸系统中严重的病理学改变和早死。很少患者可幸存超过25年。用可获得的抗生素对这些感染的治疗造成了全世界范围的治疗问题，尤其是在刚过去的几年中。因为绝大多数细菌株系显示对所有抗生素包括最后手段的抗生素万古霉素的抗性，所以对这些感染的抗生素治疗已变得越来越低效了。因此，迫切需要向治疗难治的和高度危险的细菌感染的医学实践中引入可替代的治疗方法。专利技术目的过去数年中细菌株系对所有抗生素的抗性已有广泛的传播，该抗生素包括最后手段的抗生素万古霉素。结果，用抗生素治疗由这些药物抗性形式的细菌引起的感染是无效的。该状况已造成了巨大的治疗问题。因而，迫切需要向治疗难治的细菌感染的医学实践中引入其他的治疗方法。考虑到上述目的，本专利技术致力获得复价噬菌体株系，该噬菌体株系可用于生产在治疗细菌感染中具有保证的效力的制备物，而无需对每一个病例单独选择噬菌体。在此，本专利技术的目的是提供允许获得高纯度的噬菌体制备物的途径，该制备物尤其不含内毒素。本专利技术的一个特别的目的是获得多价的噬菌体制备物，该制备物可有效应用于治疗与粘稠物阻塞症相关的细菌感染，而无需每次单独选择噬菌体。专利技术概述本专利技术提供获得复价噬菌体株系的方法，通过该方法a)积聚足够数目(n)的在给定区域随机出现的确定属的细菌病原体的不同株系，在此分离的细菌株系优选为药物抗性的，b)积聚足够数目的对该给定属的至少一个细菌株系特异的不同噬菌体株系，c)确定所积聚的噬菌体株系对每种所积聚的细菌株系的裂解活性，然后计算p值，该值为由给定的噬菌体裂解的菌株的数目与所有积聚的细菌株系的数目的比例。d)对于结果所得的p值，检验n是否满足条件n≥pqd2z1-α2]]>其中q＝1-pd是不大于0.1的常数，最适地不大于10％pz1-α是依赖于置信因子1-α的正态分布的随机变量，该置信因子不小于0.95，e)选择满足在d)中限定的标准且具有不小于2/n的p值(优本文档来自技高网...

【技术保护点】
获得复价噬菌体株系的方法，该方法特征在于：　　　　ａ）　　积聚足够数目（ｎ）的在给定区域随机出现的特定物种的病原体细菌株系，在此分离的细菌株系最适为抗药性株，　　　　ｂ）　　积聚足够数目的对至少一种给定种的细菌株系特异的噬菌体株系，　　　　ｃ）　　确定所积聚的噬菌体株系对每种所积聚的细菌株系的裂解活性，然后估计ｐ值，该值为由给定的噬菌体裂解的细菌株系的数目与所有积聚的细菌株系的数目的比例。　　　　ｄ）　　从结果所得的ｐ值，检验ｎ是否满足条件：　　　　ｎ≥（ｐｑ／ｄ↑［２］）ｚ↓［１－α］↑［２］　　　　其中：ｑ＝１－ｐ　　　　ｄ是不大于０．１的常数，最适地不大于１０％ｐ　　　　ｚ↓［１－α］是依赖于置信因子１－α的正态分布的随机变量，该置信因子不小于０．９５　　　　ｅ）　　选择满足ｄ）中的标准且具有不小于２／ｎ的ｐ值，最适地不小于０．５的噬菌体株系。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：B威必尔达布罗斯卡，M姆尔兹克，A格斯克，J伯拉特恩斯克，M鲁萨克泽拉首斯卡，D斯皮尔，
申请(专利权)人：波兰科学院免疫和实验治疗研究所，
类型：发明
国别省市：PL[波兰]