用于治疗神经退行性疾病的组合物和方法技术

本发明专利技术公开了用于治疗已经存在神经元损伤的患者的组合物和方法。所述组合物和方法使用以腺伴随病毒（ＡＡＶ）为基础的基因传递系统来传递神经胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＦ）到患有神经退行性病症（例如帕金森氏病）的患者。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总体上涉及用于基因传递的组合物和方法。本专利技术特别涉及用腺伴随病毒作为载体的基因传递系统传递神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)来治疗由神经退行性疾病引起的预先存在的神经元损伤，如帕金森氏病。
技术介绍
中枢神经系统疾病是主要的公共健康问题。帕金森氏病(PD)仅在美国就影响了一百万人以上。PD在临床上表现为自主运动减少、行走困难、姿势不稳定、僵硬和颤动。PD是一种进行性神经变性疾病，主要影响黑质(SN)中的多巴胺能(DA)神经元。目前，多种中枢神经系统疾病是通过系统给予治疗药物来治疗的。但是系统给药经常是无效的，因为药物不能通过血脑屏障。即使这些化合物能成功穿过血脑屏障，他们将导致中枢神经系统副作用。因此，许多可能有效的化合物如蛋白质，不能通过系统给药。目前可以获得的治疗PD的目标在于替代纹状体中的多巴胺以恢复运动功能。但是，必须开发阻止或减缓持续进行的退化进程的治疗干涉(Dunnett等，Nature(1999)399A32-39)。神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是目前发现的对多巴胺能(DA)神经元最有效的神经营养因子，并经验证在体内和体外都可增强多巴胺能(DA)神经元存活(Bjorklund等，Brain Res.(2000)88682-98；Bohn，M.C.，Mol.Ther.(2000)1494-496；Ozawa等，J.Neural Transm.Suppl.(2000)58181-191)。但是，GDNF蛋白给药到中枢神经系统是成问题的。GDNF仅在很短的时间内保留活性，而且由于GDNF较大，不能穿过血脑屏障，这使直接给药到脑成为仅有的可行的传递方法。这必然要求立体定位注射传递GDNF到脑或脑室内(ICV)，该传递方式严重地限制了它的治疗应用。因此，在体内基因直接转移提供了更有效的传递GDNF的方法。腺伴随病毒(AAV)曾成功的用于基因治疗的基因传递。腺伴随病毒(AAV)基因组是线性的，包含大约4681个核苷的单链DNA分子。AAV基因组通常在两端各有一个反向末端重复区(ITR)，两端之内为非重复基因组。该ITR的长度大约145bp。该ITR具有多重功能，包括作为DNA复制的起始点，作为病毒基因组的包装信号。基因组内部非重复部分包括两个大的可读框，已知是AAV复制(rep)基因和衣壳(cap)基因。该rep和cap基因编码可使病毒复制并包装成病毒体的病毒蛋白。具体地说，由AAV rep区域表达至少4个病毒蛋白，根据它们的表观分子量命名为Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV cap区域编码至少3个蛋白，VP1、VP2和VP3。通过去除AAV基因组内非重复部分(即rep和cap基因)并在ITR中间插入外源基因，将AAV改造成传递目的基因。所述外源基因通常功能性连接一个外源启动子(组成型、细胞特异型、或诱导型)，该启动子在适合的条件下可在患者的靶细胞中启动基因表达。还可包括终止信号如多聚腺苷酸化位点。AAV依赖于辅助病毒，即它需要与一个辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或牛痘)共同感染才能形成AAV病毒体。在没有辅助病毒共同感染时，AAV是潜伏状态，病毒基因组插入到宿主细胞染色体中，但是不产生可感染的病毒体。之后通过辅助病毒感染“援助”整合基因组，使它复制并包装其基因组成为感染AAV病毒体。AAV可感染不同种细胞，而辅助病毒必须是与宿主细胞同种的。例如，人AAV在犬科腺病毒共同感染犬科细胞中可以复制。在啮齿类和灵长类PD模型中，研究表明利用AAV、腺病毒(Ad)或慢病毒载体型系统传递GDNF基因保护黑质DA神经元，如果在注射神经毒素前或刚刚注射后给药则还可恢复黑质纹状体通路(Choi-Lundberg等，Science(1997)275838-841；Mandel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)9414083-14088；Bilang-Bieuel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)948818-8823；Choi-Lundberg等，Exp.Neurol.(1998)154261-275；Mandel等，Exp.Neurol.(1999)160205-214；Kirik等，J.Neurosci.(2000)204686-4700；Bensadoun等，Exp.Neurol.(2000)16415-24；以及Kordower等，Science(2000)290767-773)。然而以前的研究表明当DA神经元损坏后延迟给予GDNF，剩下的DA神经元是少量和大量的恢复功能反应了仍然存活的DA神经元和保持黑质纹状体的联系的数量(Kirik等，J.Neurosci.(2000)204686-4700；Connor等，Gene Therapy(1999)61936-1951；Winkler等，J.Neurosci.(1996)167206-7215；Natsume等，Exp.Neurol.(2001)169231-238)。因此，以前没有证明在退化进程的晚期长期利用AAV载体系统传递GDNF的效力。PD是特征为进行性DA退化的疾病，在明显的症状出现以前DA神经元数就明显减少了。因此，临床上更重要的是弄清楚以延迟的方式传递GDNF基因是否能够挽救在已经存在重度的黑质纹状体DA退化的动物模型的DA神经元和改善行为。此外，还不清楚载体源性GDNF在黑质中能否由轴突末端向DA神经元细胞体逆向转运。专利技术概述为了治疗已经存在的神经元损伤，本领域需要替代方法传递GDNF。本专利技术以下面的发现为基础AAV载体介导GDNF基因传递到重度的黑质纹状体多巴胺能(DA)去神经的患者，促进黑质(SA)中DA神经元的存活，提高酪氨酸羟化酶(TH)-阳性DA纤维的密度，甚至在退化进程发生以后改善行为和生化缺陷。此外转基因产生的GDNF在黑质中由纹状体到DA细胞体逆向转运，甚至在DA细胞大量丧失之后，保持黑质纹状体通路的功能联系。因此，在一个实施方案中，本专利技术涉及治疗已经存在的神经元损伤的哺乳动物患者的方法。该方法包括给予患者中枢神经系统重组AAV病毒体，所述重组AAV病毒体包括有效连接包括启动子的表达控制元件的编码GDNF多肽的多核苷酸，在体内神经细胞中表达该多核苷酸的条件下提供治疗效果。在某些实施方案中，已经存在的神经元损伤包括中度或重度黑质网状体多巴胺能(DA)去神经。在另外的实施方案中，神经细胞在体内转导，重组AAV病毒体给药到所述患者的纹状体内。在其它实施方案中，利用强力输送系统(CED)将重组AAV病毒体给药到纹状体。在某些实施方案中患者是人。在其它实施方案中，本专利技术涉及治疗已经存在的神经元损伤的哺乳动物患者的方法。已经存在的神经元损伤包括中度到重度黑质纹状体DA去神经，该方法包括将包含重组AAV病毒体的组合物给药到患者的纹状体，所述重组AAV病毒体包含有效连接包括启动子的表达控制元件的编码GDNF多肽的多核苷酸，在导致体内神经细胞转导的条件下，通过体内转导神经细胞来表达多核苷酸以达到治疗效果。此外，所述重组AAV病毒体可以利用CED给药到所述患者的纹状体。在另外的实施方案中，本专利技术涉及治疗已经存在的神经元损伤的哺乳动物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物在治疗已经存在神经元损伤的哺乳动物患者中的应用，该应用将所述组合物给予到所述患者的中枢神经系统，其中所述组合物包含重组腺伴随病毒（ＡＡＶ）病毒体，其中所述病毒体包含编码神经胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＦ）多肽的多核苷酸，该多核苷酸与包括启动子的表达控制元件有效连接。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：小泽敬也，村松慎一，池口邦彦，中野今治，
申请(专利权)人：田边制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]