高纯度蚓激酶的制备方法及由其制备的药物制剂技术

本发明专利技术公开一种高纯度蚓激酶的制备方法及以其为原料药的制剂。本发明专利技术通过采用单克隆抗体技术实现蚓激酶活性组分的再纯化，从而得到高纯度蚓激酶，该方法的特点是所获酶的专一性强，活性高，达到每毫克蛋白２０万单位以上；经高效液相色谱测试为单一组分；在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现一条带，分子量为３２０００±２０００道尔顿；氨基酸序列分析，Ｎ－末端１０个氨基酸序列为：Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ，以所述高纯度蚓激酶为原料药可以制成可供口服、肌注、以及静脉注射与静脉输液多种途径给药的制剂，用于血栓性疾病的治疗。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蚓激酶的制备方法，更具体地说，涉及高纯度蚓激酶的制备方法和由其制备的可供口服、肌注及静脉给药的多种剂型的药物制剂。
技术介绍
血栓性疾病的高发病率、高死亡率及高致残率严重威胁人类的生存，溶栓性药物是治疗该病的首选用药。目前临床上使用的溶栓性药物中普遍存在易引起出血的副作用；有的价格昂贵，一般百姓难以承受；有的稳定性较差，保存条件要求较高，给用药者带来很多不便；有的品种给药方式单一，只有口服、或只有静脉或肌肉注射，使用药范围受到很大限制。 蚯蚓在中药中统称为地龙，可分为双胸蚓(Bimastos)、赤子爱胜蚓(Eisenia Foetida Sarigny)、锯齿远蚓(Amynthasdancataa)及参环毛蚓(广地龙)等不同种属，在我国早已被列入药源，其中作为活血化瘀应用已有几千年的历史。研究表明，新鲜的蚯蚓体内含有多种蛋白酶类，其中一组具有强烈溶解纤维蛋白及血栓作用的丝氨酸蛋白酶由日本Mihara等于八十年代首次发现，命名为蚓激酶(Thromb Heamostas 1983，50258～263)，由此引起了国内外诸多学者的关注，开始了对蚓激酶从分离纯化和理化性质到药效学研究与临床应用等方面的广泛研究。大量的研究证实蚓激酶广泛存在于不同种属蚯蚓体内，是一组富含酸性氨基酸，等电点pl3-5，分子量20000～40000道尔顿，具有激酶和纤溶酶双重功能的丝氨酸蛋白酶它既可类似纤溶酶直接降解纤维蛋白及纤维蛋白原，又类似尿激酶、链激酶等激活纤溶酶原形成纤溶酶，起到纤溶酶原激活剂的作用。蚓激酶的最大特点是稳定性好，纤溶活性强，药理作用明显，副作用小，可做成各种剂型的药品，且来源广泛，具有广泛开发价值。近20年来，不少单位的研究人员都在力求将蚓激酶的研究推向实际应用，先后有各种各样的分离纯化技术问世，但是直到目前为止，还没有一套成熟的制备高纯度蚓激酶技术真正转化为生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高纯度蚓激酶的制备方法，该方法的特点是得到的高纯度蚓激酶的比活达到每毫克蛋白20万单位以上；经高效液相色谱测试为单一组分；在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现一条带，分子量为32000±2000道尔顿；氨基酸序列分析，N-末端10个氨基酸序列为Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr本专利技术的再一个目的在于提供以高纯度蚓激酶为原料药制成的可供口服、肌注、以及静脉注射与静脉输液多种途径给药的药物制剂。 本专利技术公开一种高纯度蚓激酶的制备方法，包括以下步骤(1)蚓激酶粗品的提取取鲜活蚯蚓用水洗净，加入食盐处理；加入pH6.8～8.3的缓冲液，用胶体磨制备匀浆；将匀浆液速冻，再融化；将匀浆液加热，去除对热不稳定的杂蛋白；将匀浆液离心，取上清液；上清液经超滤浓缩，截留分子量为10000～50000道尔顿的组分，冷冻干燥即为蚓激酶粗品。 (2)蚓激酶粗品的纯化将步骤(1)中的蚓激酶粗品溶于缓冲液中，离心，取上清液用离子交换层析分离，得到活性组分；(3)蚓激酶活性组分的再纯化将步骤(2)中的蚓激酶活性组分用亲和层析平衡缓冲液溶解，用单克隆抗体亲合层析柱进行再纯化，用缓冲液平衡至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，再用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液洗脱，收集活性洗脱峰，冷冻干燥得到高纯度的蚓激酶。 本专利技术公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，蚯蚓包括双胸蚓、赤子爱胜蚓、参环毛蚓或锯齿远蚓。 本专利技术公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸。 本专利技术公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，步骤(2)中离子交换层析采用羧甲基葡聚糖凝胶柱、二乙氨基葡聚糖凝胶柱或琼脂糖凝胶柱层析，先用缓冲液平衡脱洗，再用含有0～0.5mol/LNaCl缓冲液进行梯度洗脱。 本专利技术公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，步骤(3)中单克隆抗体亲和层析柱是由蚓激酶抗体偶联到经过溴化氰活化处理的羧甲基葡聚糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶的多糖基质上制得的。 本专利技术公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，蚓激酶抗体由如下步骤制备得到用高效液相色谱纯化并经定性的蚓激酶与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对小鼠皮下注射免疫；取经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠骨髓瘤细胞混合，加入分子量为40000～60000聚乙二醇作用后，将细胞混合液分别接种在多孔细胞培养板孔内；将接种细胞混合液的细胞培养板置于CO2培养箱内培养，按时间阶段选择不同的培养基；收集细胞分泌液，对单克隆抗体进行筛分得到稳定的蚓激酶抗体。 本专利技术公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠骨髓瘤细胞按5～10∶1的比例混合。 本专利技术公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，培养基的选择按照第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培养基，第5～10天改用HT培养基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培养基。 按照另一方面，本专利技术公开一种由上述方法制得的高纯度蚓激酶，其比活达到每毫克蛋白20万单位以上；经高效液相色谱测试为单一组分；在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现一条带，分子量为32000±2000道尔顿；氨基酸序列分析，N-末端10个氨基酸序列为Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr按照又一方面，本专利技术还公开了由本专利技术的高纯度蚓激酶为原料药制备的药物制剂，其包含有治疗有效量的本专利技术的高纯度蚓激酶、药学上可接受的药用辅料。使用常用的药物制剂的制备方法可以制成下列剂型的药物制剂(1)蚓激酶口服肠溶剂(片剂、胶囊等)；(2)蚓激酶注射液；(3)注射用蚓激酶；(4)静脉注射用蚓激酶；(5)冻干静脉注射用蚓激酶。 本专利技术公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，采用单克隆抗体技术实现蚓激酶活性组分的再纯化。单克隆抗体技术是将具有分泌特定抗体能力的B淋巴细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。通过有限稀释法从杂交瘤细胞中筛选出特定的一个细胞集落(即克隆)，再由该集落的细胞不断培养增殖而形成细胞系，由此细胞分泌的抗体即为单克隆抗体。单克隆抗体的主要特点是①抗体的分子结构高度均一，甚至氨基酸序列及空间构型均相同；②抗体识别的是抗原分子上单一抗原位区，且所有抗体分子均相同，由此具有高度特异性；③产生抗体的细胞是无性细胞系，可长期传代并保存，因此只要该细胞系建立，便可持续稳定地生产同一性质的抗体。 通过本专利技术公开的制备方法得到的高纯度蚓激酶，其纤溶活性达到每毫克1蛋白20万单位以上；依照电泳法(中国药典2000年版二部附录V F第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)显示为一条带，分子量应为32000±2000道尔顿；依照高效液相色谱法测定(中国药典2000年版二部附录VI H)，呈现一个峰的水平，电泳法和高效液相色谱法(HPLC)测定结果都表明高纯度蚓激酶为单一组分；氨基酸序列分析，N-末端10个氨基酸序列为Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr；经琼脂糖-纤维蛋白平板法测定，高纯度蚓激酶样品出现的纤溶圈比同样浓度的蚓激酶标准品更为清晰。 取高纯度蚓激酶，用氯化钠注射液制成每1ml含20000单位的溶液，按热原检查本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高纯度蚓激酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）蚓激酶粗品的提取：取鲜活蚯蚓用水洗净，加入食盐处理；加入ｐＨ６．８～８．３的缓冲液，用胶体磨制备匀浆；将匀浆液反复冻融；将匀浆液加热，去除对热不稳定的杂蛋白；将匀浆液离心， 取上清液；上清液经超滤浓缩，截留分子量为１００００～５００００道尔顿的组分，冷冻干燥制得蚓激酶粗品；（２）蚓激酶粗品的纯化：将步骤（１）中获得的蚓激酶粗品溶于缓冲液中，离心，取上清液用离子交换层析柱分离，得到蚓激酶活性组分； （３）蚓激酶活性组分的再纯化：将步骤（２）中的蚓激酶活性组分用亲和层析平衡缓冲液溶解，用单克隆抗体亲合层析柱进行再纯化，用缓冲液平衡至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，再用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液洗脱，收集活性洗脱峰，冷冻干燥得到高纯度的蚓激酶。

【技术特征摘要】
1.一种高纯度蚓激酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)蚓激酶粗品的提取取鲜活蚯蚓用水洗净，加入食盐处理；加入pH6.8～8.3的缓冲液，用胶体磨制备匀浆；将匀浆液反复冻融；将匀浆液加热，去除对热不稳定的杂蛋白；将匀浆液离心，取上清液；上清液经超滤浓缩，截留分子量为10000～50000道尔顿的组分，冷冻干燥制得蚓激酶粗品；(2)蚓激酶粗品的纯化将步骤(1)中获得的蚓激酶粗品溶于缓冲液中，离心，取上清液用离子交换层析柱分离，得到蚓激酶活性组分；(3)蚓激酶活性组分的再纯化将步骤(2)中的蚓激酶活性组分用缓冲液溶解，用单克隆抗体亲合层析柱进行再纯化，用缓冲液平衡至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，再用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液洗脱，收集活性洗脱峰，冷冻干燥得到高纯度的蚓激酶；其中步骤(2)中离子交换层析采用羧甲基葡聚糖凝胶柱或二乙氨基葡聚糖凝胶柱或琼脂糖凝胶柱层析，先用缓冲液平衡脱洗，再用含有0～0.5mol/LNaCl的缓冲液进行梯度洗脱；所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；步骤(3)中单克隆抗体亲和层析柱是由蚓激酶抗体偶联到经过溴化氰活化处理的羧甲基葡聚糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶的多糖基质上制得的。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，蚯蚓包括双胸蚓、赤子爱胜蚓、锯齿远蚓或参环毛蚓。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，蚓激酶抗体由如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：马骉，魏化伟，吴丹，宋梦薇，张颖，
申请(专利权)人：北京赛生药业有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]