一种抗ＳＡＲＳ病毒的ｓｉＲＮＡ，是下列核苷酸序列之一： １）序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：１的ＲＮＡ序列； ２）与序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：１限定的ＲＮＡ序列具有９５％以上同源性，且具有相同功能的ＲＮＡ序列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗SARS病毒的siRNA及其应用。
技术介绍
严重急性呼吸系统综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的治疗尚无针对性特效药物。目前，临床用于治疗SARS药物主要是针对患者症状给予解热镇痛药，镇咳祛痰药，续鼻导管吸氧，或是给予广谱抗生素，糖皮质激素，广谱抗病毒药物，增强免疫功能的药物，以及中药辅助治疗等方式。以上方法都存在着缺乏特异针对性且副作用较多等弊病。另外，用SARS患者恢复期血清疗法治疗严重SARS患者虽然取得了较满意的疗效，但该方法从取材上毕竟存在很大局限，而且由于非典冠状病毒存在多个变种，抗血清是否对这些变种都有抑制效果尚属未知。迄今为止，实验室开发抗SARS药物的思路主要集中于筛选小分子化合物库及天然产物，争取找到阻断SARS病毒感染的药物；制备抗SARS病毒的疫苗等方面。但是，两种方法所需周期均较长。1995年康奈尔大学的Su Guo博士在用反义RNA阻断线虫基因表达的实验中首次发现，反义和正义RNA都阻断了基因的表达；到1998年，Andrew Fire的研究证明，真正起作用的是双链RNA，这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预(RNA interference，RNAi)。目前很多实验室利用siRNA(小干扰RNA，smallinterfering RNA)在体内能干扰特定基因表达的效果进行疾病治疗的研究，已经进行相关治疗研究的疾病有爱滋病，乙肝，白血病等。由于SARS病毒侵入人体后，其中的RNA分子利用人细胞的合成系统进行复制病毒RNA，以及合成S，M，N和E等蛋白。因此，利用RNAi阻断相关蛋白的表达，从而达到治疗SARS的目的是可行的且迅速、简便。制备siRNA可通过化学合成，体外试剂盒合成技术。这两种技术都存在获得siRNA的价格昂贵，实验的重复性差的问题。专利技术创造内容本专利技术的目的是提供一种抗SARS病毒的siRNA。本专利技术所提供的抗SARS病毒的siRNA，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的RNA序列；2)与序列表中SEQ ID №1限定的RNA序列具有95％以上同源性，且具有相同功能的RNA序列。SEQ ID №1的RNA序列由19个碱基组成。可表达本专利技术的抗SARS病毒的siRNA序列的细胞系及表达载体均属于本专利技术的保护范围，实验证明，可表达抗SARS病毒的siRNA序列的真核表达载体pSUPER.retro-SARS-siRNA1具有抑制SARS病毒感染Vero细胞的作用。编码本专利技术的抗SARS病毒的siRNA序列的DNA也属于本专利技术的保护范围，如序列表中的SEQ ID №3(sense strand，有义链)和SEQ ID №4(antisense strand，反以链)，其编码框如图2所示，图中划线部分的核苷酸序列为编码框。本专利技术的抗SARS病毒的siRNA可以通过构建其真核表达载体并在合适的宿主细胞中培养该真核表达载体而得到，克服了化学合成、体外试剂盒合成siRNA技术中存在的获得siRNA的价格昂贵、实验的重复性差的问题，而且本专利技术的抗SARS病毒的siRNA的作用效果显著，无副作用，将在SARS病毒的防治中起到重要的作用。附图说明图1为真核表达载体pSUPER.retro的物理图谱图2为siDNA-1的序列示意3为siDNA-2的序列示意4为SARS病毒感染Vero细胞24小时的照相结果图5为pSUPER.retro-SARS-siRNA1转染VERO细胞后SARS病毒滴定结果具体实施方式实施例1、抗SARS病毒的siRNA的合成以SARS病毒的复制酶，聚合酶以及引导区的预测基因区域作为靶位点(Zhao等，2003，Tsinghua Science and Technology，8(4)389-394)，设计并合成了如SEQ ID №1和SEQ ID №2所示的siRNA1和siRNA2的siDNA1和siDNA2序列，siDNA11的序列如序列表中SEQ ID №3、SEQ ID №4和图2所示；siDNA2的序列如序列表中SEQ ID №5、SEQ ID №6和图3所示；图2和图3中，划线部分的核苷酸序列为编码框。实施例2、抗SARS病毒的siRNA的功能siRNA表达载体的构建步骤及原理为利用真核表达载体系统pSUPER.retro(图1)，将siRNA相对应的双链DNA插入载体启动子序列，当载体转入细胞后，在启动子的作用下，能够稳定的表达相应的siRNA。而且pSUPER.retro真核表达载体系统所具备的病毒包被的能力，为下一步用siRNA真核表达载体感染实验动物提供了条件(Brummelkamp等，2002，Science 296550)。根据以上步骤和原理，按照pSUPER.retro真核表达载体系统的要求，利用HindIII(1441)和BglII(1447)限制性内切酶将siDNA1和siDNA2序列插入pSUPER.retro，构建了siRNA1和siRNA2的真核表达载体pSUPER.retro-SARS-siRNA1和pSUPER.retro-SARS-siRNA2。将构建好的siRNA真核表达载体于大肠杆菌E.coli中扩增，氨苄霉素抗性筛选提取质粒。24孔板培养Vero(非洲绿猴肾细胞)细胞，用脂质体将质粒转入Vero细胞，24小时后加入SARS病毒，同时设立正常细胞对照，病毒感染细胞对照，pSUPER.retro空载体转染，病毒感染细胞对照。病毒感染24小时后照相，取细胞上清液做病毒滴度测定。照相结果如图4所示，表明siRNA1的真核表达载体具有抑制SARS病毒感染Vero细胞的作用，而siRNA2的真核表达载体无显著抑制病毒繁殖的作用。病毒滴度测定结果如图5所示，进一步表明上述结论正确。图3中，anti-SARS-RNAi1表示pSUPER.retro-SARS-siRNA1，anti-SARS-RNAi2表示pSUPER.retro-SARS-siRNA2。序列表<160>6<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>1cttacatagc tcgcgtctc 19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>2gttctctaaa cgaacttta 19<210>3<211>64<212>DNA<213>人工序列<400>3gatccccctt acatagctcg cgtctcttca agagagagac gcgagctatg taagtttttg 60gaaa 64<210>4本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晔光，王治，王健伟，任丽丽，孟安明，
申请(专利权)人：清华大学，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：
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