研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷Re作用的实验方法技术

本发明专利技术涉及一种研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷Re作用的实验方法，该方法包括以下步骤：S1：选取健康雄性Wistar大鼠作为实验对象，随机分为假手术组、模型组及人参皂苷Re低、中、高剂量组，根据分组情况，分别给予大鼠低、中、高低剂量人参皂苷Re，与模型组及假手术组大鼠再次进行Morris水迷宫测试；S2：电镜下观察各组大鼠海马组织学及超微结构的变化，结果进一步证明血管性痴呆大鼠模型建立可靠；通过组间比较结果提示人参皂苷Re可减轻血管性痴呆大鼠海马缺血损伤程度；S3：应用Western blot法测定线粒体代谢过程中的关键酶亚基蛋白表达：即细胞色素C氧化酶IV亚基蛋白表达及丙酮酸脱氢酶A1亚基蛋白表达；S4：应用荧光光度计技术检测大鼠海马线粒体呼吸态4H2O2产率。

Experimental methods to study the effects of mitochondrial energy metabolism disorder and ginsenoside Re on the pathogenesis of vascular dementia

The invention relates to a experimental method to study the occurrence of vascular dementia in the process of mitochondrial energy metabolism disorders and the role of ginsenoside Re, the method comprises the following steps: S1: select healthy male Wistar rats as subjects were randomly divided into sham group, model group and ginsenoside Re low, medium and high dose group, according to grouping, rats were treated with low, medium and high dose of ginsenoside Re, and the model group and sham operation group rats again Morris water maze test; S2: changes in hippocampus of rats and the ultrastructure under electron microscope, the results further prove that the model of vascular dementia rats to establish reliable through the comparison between groups; results suggest that ginsenoside Re can reduce the degree of ischemic damage in hippocampus of vascular dementia rats; S3: Determination of the key enzyme of mitochondrial metabolism in the process of application of Western blot method Subunit protein expression: cytochrome C oxidase IV subunit protein expression and pyruvate dehydrogenase A1 subunit protein expression; S4: fluorescence photometry technology was used to detect the respiratory rate 4H2O2 yield of rat hippocampus mitochondria.

【技术实现步骤摘要】
研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷Re作用的实验方法
本专利技术涉及一种研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷Re作用的实验方法。
技术介绍
血管性痴呆(vasculardementia，VD)是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成记忆、认知和行为等脑区低灌注的脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。是继阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)之后第二常见的痴呆类型，同时也是老年人中最常见的痴呆类型，目前全世界约有30％的痴呆患者为血管性痴呆患者，一项近期的调查显示我国血管性痴呆的患病率约为0.8％。有丹麦学者统计，每个血管性痴呆病人平均每年要花费约合14000美元用于治疗及日常照料。目前人们用于血管性痴呆病人的治疗及日常照料的花费已高于其他任何一种痴呆类型，而血管性痴呆病人的数量在高于65岁的老年人中仍在成倍的增加。随着我国进入老龄化社会，血管性痴呆将成为我们所要面临的重要的公共卫生问题。由于人们至今对VD的发病机制尚不明确，临床上仅能针对症状进行相应的治疗，不能阻止或逆转疾病进程。为了能够更好地治疗及预防血管性痴呆，近年学者们围绕着VD的发病原因，发病机制进行了深入的研究，线粒体(mitochondria，mito)功能障碍在血管性痴呆发病中所起的作用受到越来越多的关注。线粒体是一种广泛分布于真核细胞内的细胞器，其参与细胞内自由基形成、细胞内离子跨膜转运和细胞凋亡等过程，但其最为重要的功能是进行ADP氧化磷酸化，生成ATP，为细胞提供生物动能。线粒体是糖、脂肪和氨基酸最终氧化磷酸化释放能量的场所。通过线粒体内的NADH(还原型辅酶I)氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链/FADH2(还原型黄素腺嘌呤二核苷酸)氧化呼吸链2条电子传递链(electrontransportchain，ETC)的传递作用，线粒体内营养物质代谢所产生的成对氢原子(2H)与机体吸入的氧结合生成水。呼吸链在传递氢的过程中偶联氧化磷酸化，在ATP酶的作用下将ADP合成ATP为机体组织提供基本代谢所需要的能量。线粒体的上述产能过程是通过一系列复杂的酶促反应完成的，当相关酶促反应不能正常进行时，线粒体不能有效合成ATP，呼吸链电子传递过程中所产生的副产物氧自由基蓄积，线粒体耗氧下降，不能为组织提供足够的能量，机体组织就会供能不足，出现相应功能障碍。细胞生命活动所需能量90％以上由线粒体氧化磷酸化提供。大脑作为思想行为中枢对氧的需求非常大。尽管大脑的重量只占身体总重量的2％，但氧的消耗却占20％。线粒体功能的改变直接影响神经细胞的功能。线粒体功能正常与否，是决定细胞生存或死亡的关键因素。VD目前临床治疗效果不甚理想，西药治疗主要是应用胆碱酯酶抑制剂及促进脑代谢药物等，而在中医学上，VD属于神志疾病，中医药在防治痴呆方面有独特的经验。人参是我国传统的名贵中药，属五加科草本植物，素有“百草药王”之美称，主要产于吉林省长白山一带，是我国“东北三宝”之一，具有广泛的药理作用。从人参中分离出的人参皂苷Re被认为是人参促智和延缓衰老作用的主要有效成分，其中Re含量较高，是人参的一种活性成分，有报道显示，人参皂苷Re对自然衰老大鼠的学习记忆障碍有改善所用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于本研究通过进行一系列的体内及体外试验研究血管性痴呆发生发展过程中的线粒体能量代谢障碍及人参皂苷Re的神经保护作用，实验方法简单，效果好，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷Re作用的实验方法，该方法包括以下步骤：S1：选取健康雄性Wistar大鼠作为实验对象，随机分为假手术组、模型组及人参皂苷Re低(5mg/kg)、中(10mg/kg)、高(20mg/kg)剂量组，采用双侧颈总动脉分次结扎方法制备血管性痴呆大鼠模型，并利用Morris水迷宫定位航行试验训练检查大鼠的行为及记忆功能，结果示手术造模组大鼠逃避潜伏期明显较假手术组长，表明大鼠学习记忆能力下降，证明模型制备成功；根据分组情况，分别给予大鼠低、中、高低剂量人参皂苷Re，与模型组及假手术组大鼠再次进行Morris水迷宫测试；S2：电镜下观察各组大鼠海马组织学及超微结构的变化，结果进一步证明血管性痴呆大鼠模型建立可靠，通过组间比较结果提示人参皂苷Re可减轻血管性痴呆大鼠海马缺血损伤程度；S3：应用Westernblot法测定线粒体代谢过程中的关键酶亚基蛋白表达：即细胞色素C氧化酶IV亚基蛋白表达及丙酮酸脱氢酶A1亚基蛋白表达；S4：应用荧光光度计技术检测大鼠海马线粒体呼吸态4H2O2产率。与现有技术相比，本专利技术的研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷Re作用的实验方法具有以下优点：采用本方法可以表明，缺血致血管性痴呆模型大鼠存在海马线粒体代谢过程中的关键酶亚基蛋白即细胞色素C氧化酶IV亚基蛋白表达及丙酮酸脱氢酶A1亚基蛋白表达下降。提示海马线粒体代谢过程中的关键酶亚基蛋白即细胞色素C氧化酶IV亚基蛋白表达及丙酮酸脱氢酶A1亚基蛋白表达下降参与了血管性痴呆的发生发展过程。而人参皂苷Re在一定时间和浓度下具有改善血管性痴呆大鼠海马线粒体代谢过程中关键酶亚基蛋白表达下降的作用，提示人参皂苷Re对血管性痴呆大鼠海马线粒体具有一定的保护作用。本方法简单，实验效果突出。通过本实验研究发现线粒体呼吸功能障碍参与了血管性痴呆的发生发展过程，线粒体生物动能机制是血管性痴呆的发病机制之一。同时证明人参皂苷Re对血管性痴呆大鼠海马线粒体具有保护和治疗作用。附图说明图1是本专利技术的电镜下观察假手术组的大鼠海马组织的HE染色结果；图2是是本专利技术的电镜下观察模型组的大鼠海马组织的HE染色结果；图3是本专利技术的电镜下观察低剂量组的大鼠海马组织的HE染色结果；图4是本专利技术的电镜下观察高剂量组的大鼠海马组织的HE染色结果；图5是本专利技术的电镜下观察假手术组的大鼠海马组织的超微结构的变化结果；图6是本专利技术的电镜下观察模型组的大鼠海马组织的术后1个月超微结构的变化结果；图7是本专利技术的电镜下观察模型组的大鼠海马组织的术后6个月超微结构的变化结果；图8是本专利技术的电镜下观察高剂量组的大鼠海马组织的术后1个月超微结构的变化结果；图9是本专利技术的电镜下观察高剂量组的大鼠海马组织的术后3个月超微结构的变化结果；图10是本专利技术的电镜下观察高剂量组的大鼠海马组织的术后6个月超微结构的变化结果；图11是本专利技术的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体细胞色素C氧化酶IV亚基蛋白表达测定术后1个月的变化结果；图12是本专利技术的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体细胞色素C氧化酶IV亚基蛋白表达测定术后3个月的变化结果；图13是本专利技术的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体细胞色素C氧化酶IV亚基蛋白表达测定术后6个月的变化结果；图14是本专利技术的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体丙酮酸脱氢酶A1亚基蛋白表达测定术后1个月的变化结果；图15是本专利技术的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体丙酮酸脱氢酶A1亚基蛋白表达测定术后3个月的变化结果；图16是本专利技术的电镜下观察各组的大鼠海马线粒体丙酮酸脱氢酶A1亚基蛋白表达测定术后6个月的变化结果；图17是本专利技术的电镜下观察各组的大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷Re作用的实验方法，该方法包括以下步骤：S1：选取健康雄性Wistar大鼠作为实验对象，随机分为假手术组、模型组及人参皂苷Re低、中、高剂量组，采用双侧颈总动脉分次结扎方法制备血管性痴呆大鼠模型，并利用Morris水迷宫定位航行试验训练检查大鼠的行为及记忆功能，结果示手术造模组大鼠逃避潜伏期明显较假手术组长，表明大鼠学习记忆能力下降，证明模型制备成功；根据分组情况，分别给予大鼠低、中、高低剂量人参皂苷Re，与模型组及假手术组大鼠再次进行Morris水迷宫测试；S2：电镜下观察各组大鼠海马组织学及超微结构的变化，结果进一步证明血管性痴呆大鼠模型建立可靠；通过组间比较结果提示人参皂苷Re可减轻血管性痴呆大鼠海马缺血损伤程度；S3：应用Western blot法测定线粒体代谢过程中的关键酶亚基蛋白表达：即细胞色素C氧化酶IV亚基蛋白表达及丙酮酸脱氢酶A1亚基蛋白表达；S4：应用荧光光度计技术检测大鼠海马线粒体呼吸态4H2O2产率。

【技术特征摘要】
1.一种研究血管性痴呆发生过程中线粒体能量代谢障碍及人参皂苷Re作用的实验方法，该方法包括以下步骤：S1：选取健康雄性Wistar大鼠作为实验对象，随机分为假手术组、模型组及人参皂苷Re低、中、高剂量组，采用双侧颈总动脉分次结扎方法制备血管性痴呆大鼠模型，并利用Morris水迷宫定位航行试验训练检查大鼠的行为及记忆功能，结果示手术造模组大鼠逃避潜伏期明显较假手术组长，表明大鼠学习记忆能力下降，证明模型制备成功；根据分组情况，分别给予大鼠低、中...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晴，杜建时，孔祥怡，马明，丛乐，王宇，郑丽媛，
申请(专利权)人：赵晴，
类型：发明
国别省市：吉林,22