本发明专利技术涉及从真核生物染色体ＤＮＡ中去除核酸序列的重组系统和方法，并涉及包含这些系统或用这些方法产生的转基因生物－优选地为植物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，并涉及包含这些系统的转基因生物-优选地为植物。对生物进行生物技术研究的目的尤其是在于获得商业上可利用的特定基因和基因产物的功能以及解释生物合成途径或发病机理的信息。通过此方式获得的信息可用于很多方面。用于例如产生新药，开发备选的、生物技术生产方法或产生修饰植物。植物生物技术研究的目的是产生具有有益的新特征的植物，例如用于增加农业上的产量，改进粮食的质量或用于产生特定的化学品或药物(Dunwell JM，J Exp Bot.2000；51 SpecNo487-96)。在转基因生物的产生中，由于所用方法的效率低，所以需要对已通过期望的方式(例如，稳定的转化或特别是同源重组)改造的生物体进行选择。转基因植物可通过一系列的技术来产生(参见Potrykus I.和Spangenberg G.编辑(1995)对植物的基因转移(Gene transfer toplants.)Springer，Berlin)。特别是通过根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的基因转移以及通过粒子枪对植物细胞进行的轰击在此起着重要的作用。一个重要的问题是转基因DNA一旦被稳定地导入到生物体中，其去除是困难的。抗生素或除草剂抗性基因，其在转化过程中被用作筛选的目的，保留在转基因植物中，这本质上导致这些“基因食物”产品在消费者中不被接受。因此在一段时间内，人们试图开发这样的技术，通过该技术将外源DNA整合到植物基因组的特定位点处或从该处重新去除(Ow DW和Medberry SL(1995)Crit Rev in Plant Sci 14239-261)。技术人员熟知各种用于对重组导入的核酸序列定点去除的系统。它们是基于通过序列特异性重组酶和两条侧接于待去除序列的所述重组酶的识别序列的应用。重组酶对此构建体的作用导致了侧翼序列的切除，识别序列之一仍保留在该生物体的基因组中。已有多种序列特异性重组系统被描述，例如噬菌体P1的Cre/lox系统(Dale EC和Ow DW(1991)Proc Natl AcadSci USA 8810558-10562；Russell SH等.(1992)Mol Gene Genet 23449-59；Osborne BI等(1995)Plant J.7，687-701)，酵母FLP/FRT系统(Kilby NJ等(1995)Plant J8637-652；Lyznik LA等(1996)NucleicAcids Res 243784-3789)，Mu噬菌体Gin重组酶，大肠杆菌(E.coli)Pin重组酶或质粒pSR1的R/RS系统(Onouchi H等(1995)Mol.Gen.Genet.247653-660；Sugita K等(2000)Plant J.22461-469)。在这里，重组酶(例如Cre或FLP)与其相应的重组序列(分别为34bp lox序列和47bpFRT序列)特异性地相互作用来用于去除或转化插入的序列。关于这些系统被成功应用到植物中的报道是有限的。因此，David Ow’小组证明用于植物转化的侧接了两个lox序列的选择标记可通过Cre的表达从该植物基因组中重新切除(Dale EC和Ow DW(1991)Proc Natl Acad Sci USA8810558-10562)。序列特异性重组系统的缺点是反应的可逆性，也即所讨论的标记基因切除和整合之间存在平衡状态。这些经常会导致突变的选择，即，一但突变阻碍了lox识别序列与酶的进一步相互作用，(不希望得到的)产品就要被从平衡状态中去除并固定。这些不仅适用于Cre-lox系统，而且也适用于其它序列特异性重组酶(参见上文)。另一个缺点是重组酶的一个识别序列保留在该基因组中，其因此被修饰。这些也许影响生物体的特性，例如，当识别序列修饰或破坏阅读框架或遗传调控元件例如启动子或增强子的时候。此外，保留在基因组中的识别序列排斥重组系统的进一步的应用，例如用于二次遗传修饰，因为不能排除与随后导入的识别序列相互作用。大量的染色体重排或缺失可能会产生。Zubko等描述了一种用于从烟草基因组中去除核酸序列的系统，其中待去除的序列侧接了两条来自噬菌体λ的352bp attP识别序列。侧接区域的去除在11个转基因烟草品系的两个品系中通过attP识别区域之间的自发的染色体内重组独立于辅助蛋白的表达而发生。此方法的缺点是重组或去除不能在特定的位点及时被特异性诱导，但可以自发地发生。但该方法仅仅在少量品系中有效的事实表明所讨论情况中的整合位点是趋向于不稳定的(Puchta H(2000)Trends in Plant Sci 5273-274)。在WO96/14408的第12页的图32描述了一种用于去除基因位点的方法，其中在每一情况下归巢限制性核酸内切酶I-SceI的一个识别序列被插入到欲去除的序列的相应末端。用该核酸内切酶处理导致了待去除序列的两个末端的双链断裂。游离的末端然后通过“重组”的方式被连接。这里的“重组”仅仅是一种异常重组-此也可从附图中看出(例如非同源的末端连接(NHEJ)现象)，因为没有同源的序列存在于基因组DNA的两个残留的末端。然而异常重组导致不可预知的重组结果。例如，如果阅读框架或遗传调控元件例如启动子或增强子因此被修饰或破坏，这些也许影响生物体的特性。该系统需要两条侧接于待去除片段的识别序列。已描述了用限制性酶作用在真核生物基因组例如酵母(Haber JE(1995)Bioassays 17609-620)，哺乳动物细胞(Jasin M(1996)Trends Genet.12224-228)或植物(Puchta H(1999a)Methods Mol Biol 113447-451)中产生序列特异性双链断裂。所描述的是在爪蟾卵母细胞中的质粒DNA上通过核酸内切酶I-SceI(Segal DJ和Caroll D(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92806-810)进行序列特异性切割或通过合成的、嵌合核酸酶裂解(Bibikova M等(2001)Mol Cell Biol 21(1)289-297)进行的分子内重组的诱导。该目的是在两个同源序列之间的定点重组，其中在序列之间有一个适当的核酸酶切割位点。此两种情况为染色体外的重组事件，其中每一情况下仅仅部分的染色体外的质粒DNA进行了同源重组。Posfai等人描述了一种用于在原核生物大肠杆菌中进行基因交换的方法(Posfai G等(1999)Nucleic Acids Res 27(22)4409-4415)。在这里，在该大肠杆菌基因组的内源基因和突变基因之间产生的重组，由限制性酶I-SceI诱导切割。目的和目标是用突变的转基因交换内源的基因。在大肠杆菌中进行的重组是以极为简单的方式进行，并且比高等真核生物(例如Kuzminov A(1999)Microbiol Mol Biol Rev.63(4)751-813)具有更大的效率。Dürrenberger等人描述了利用I-SceI归巢核酸内切酶在单细胞衣藻莱因哈德衣藻叶绿体中进行重组的诱导(Dürrenberger F等(1996)NucleicAcid Re本文档来自技高网...
【技术保护点】
在真核细胞或生物体中的重组系统，其包含Ⅰ）插入真核生物染色体ＤＮＡ中的转基因重组构建体，其包含的序列从５′到３′方向包括ａ１）第一同源序列Ａ和ｂ１）至少一个用于定点诱导ＤＮＡ双链断裂的识别序列和ａ２）第二同源 序列Ｂ，该同源序列Ａ和Ｂ具有足够的长度和足够的同源性以确保同源重组，以及Ⅱ）适于诱导ＤＮＡ双链在用于定点诱导ＤＮＡ双链断裂的识别序列（ｂ）处断裂的酶，或编码适于诱导ＤＮＡ双链在识别序列（ｂ）处断裂的酶的核酸序列。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：H普赫塔，C比斯根，
申请(专利权)人：太阳基因两合公司，植物遗传学和栽培植物研究所，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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