一种抗CD147抗体及其生产方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种抗CD147蛋白的纳米抗体，同时还公开了编码该纳米抗体的基因序列以及表达该纳米抗体的宿主细胞。通过本发明专利技术所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于多种癌症检测试剂的研发。

An anti CD147 antibody and its production method and Application

The invention relates to a nano antibody against CD147 protein, and also discloses a gene sequence encoding the nano antibody and a host cell expressing the nano antibody. Through the nano antibody gene sequence and host cell released by the invention, the nano antibody can be highly expressed in Escherichia coli, and is applied to the research and development of various cancer detection agents.

【技术实现步骤摘要】
一种抗CD147抗体及其生产方法和应用
本专利技术属于分子生物学和免疫学
，具体涉及噬菌体展示文库和纳米抗体重组表达技术，特别涉及一种针对CD147蛋白分子的噬菌体纳米抗体库筛选，纳米抗体的结构及其生产方法和应用。
技术介绍
CD147是一种广泛表达于造血及非造血细胞系，分子量约43-66kDa的跨膜糖蛋白，基因定位于19p13.3，其编码区编码269个氨基酸残基，包括细胞外N端2个C2型免疫球蛋区、24个氨基酸残基组成的跨膜区和C端39个氨基酸残基的胞内区。CD147广泛表达以及与其他蛋白的相互作用使之能够参与多种不同的生理病理过程，并与某些重要疾病如肿瘤、炎症等的发生发展密切相关CD147在多种肿瘤细胞、组织高表达。功能研究发现，其通过诱导周围成纤维细胞及肿瘤细胞自身产生多种基质金属蛋白酶(MMPs，包括MMP-1,MMP-2,MMP-9)降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的浸润和转移。CD147胞外区还含有3个Asn糖基化位点，表明CD147分子N端高度糖基化，提示CD147分子的N端高度糖基化，但糖基化的程度具有组织特异性，在不同组织不同种属中，由于蛋白分布不同，其糖基化方式也有所不同，不同的糖基化方式又使得蛋白发挥不同的功能。同时，CD147分子糖基化的程度决定了其激活MMP的能力，纯化的去糖基化的CD147分子不能诱导MMP分泌。大量究结果表明，各种癌组织、细胞中，CD147分子普遍高表达，并伴随高度的糖基化。CD147分子的糖基化修饰非常丰富，糖链约占总分子量的一半。目前的研究表明，肿瘤细胞中CD147的糖基化修饰对其诱导基质金属蛋白酶的分泌可能有重要意义，从而影响肿瘤的发生发展。CD147是多种肿瘤表面的靶标分子，应用相关技术制备CD147的抗体，做成诊断试剂盒或抗体药物，从而用于癌症的诊断和治疗。纳米抗体是在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术研发得到的，其分子量约为15KD，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子。最初由比利时科学家Hamers.R在骆驼血液中发现，普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻链，这些新型抗体能像正常抗体一样于抗原紧密结合，但不像单链抗体那样相互粘连聚集成块。与传统抗体相比，纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、人源化简单等优势。因此，以此纳米抗体技术研发CD147抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决以上问题的至少一个，本专利技术提供一种抗CD147抗体及其生产方法和应用。根据本专利技术的第一方面，提供一种抗CD147抗体，其含有由SEQIDNO:3所示的CDR1、由SEQIDNO:4示的CDR2、以及由SEQIDNO:5所示的CDR3。其中，该抗CD147抗体是单克隆抗体、Fab、F(ab)2、Fv、scFv、单域抗体或纳米抗体的一种。其中，该抗CD147抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术涉及的抗CD147抗体，其进一步带有标记，所述标记包括酶标记(如辣根过氧化物酶标记、碱性磷酸酶标记)、光学标记(化学发光标记)、荧光标记、同位素标记等。根据本专利技术的第二方面，提供一种基因，其编码该抗CD147抗体。其中，该基因包含SEQIDNO:2的核苷酸序列。本专利技术涉及的基因可以是DNA、cDNA、mRNA，除了编码序列以外，还包括非编码区序列，例如5’UTR和3’UTR等。根据本专利技术的第三方面，提供一种核酸构建体，其包含该基因。本专利技术涉及的核酸构建体，可以为阅读框、表达盒、操纵子、质粒、粘粒、病毒载体、噬菌体载体等。根据本专利技术的第四方面，提供一种宿主，该宿主包含该基因或者该核酸构建体。本专利技术涉及的宿主，可以为基因工程领域常用的宿主，包括原核宿主、真核宿主。所述原核宿主包括但不限于大肠杆菌，所述真核宿主包括但不限于酵母(毕赤酵母、酿酒酵母)、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。根据本专利技术的第五方面，提供一种生产该抗CD147抗体的方法，其包括：(1)培养宿主；(2)使宿主表达抗体；(3)从含有抗体的组分中分离和纯化抗体。根据本专利技术的第六方面，提供一种制备该抗CD147抗体的方法，其包括以下步骤：(1)用CD147蛋白筛选噬菌体展示抗体库；(2)阳性克隆的鉴定和测序；(3)CD147重组抗体的表达和纯化；(4)抗CD147重组抗体功能的鉴定。根据本专利技术的第七方面，提供该抗CD147抗体的用途，其用于制备检测CD147的诊断试剂盒或用于制备治疗与CD147高表达相关疾病的药物，例如肿瘤。与现有技术相比，本专利技术技术具有以下优点：(1)分子较小，药物递送。本专利技术所述抗CD147纳米抗体相对于普通抗体或抗体片段，分子较小，相比于传统抗体，具有亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、人源化简单等优势。当作为靶向分子时，本专利技术所述抗CD147纳米抗体对活性部位(效应分子)的构象影响和空间位阻都更小，效应分子活性更高，并且采用本专利技术抗CD147纳米抗体作为靶向分子时单位重量的药物中具有更高的效应分子的摩尔数。(2)免疫原性低，代谢特征好。本专利技术所述抗体即保留了所述序列形成VVH抗体的能力，又尽可能避免了非人外源蛋白的引入，兼顾了有效结合CD147的功能和尽可能低的异源性。另外，异源性的降低除了减少超敏反应以外还能延长了其在体内的半衰期，改善代谢特征。(3)亲和力高，靶向性强。scFv或抗体的片段等小分子抗原结合蛋白由于缺乏抗体分子的完整结构，通常对抗原的亲和力远远达不到完整抗体的水平。本专利技术经过长期试验，采用了高库容的噬菌体展示单域抗体文库，经过条件优化和反复筛选，最终获得的CD147纳米抗体对CD147的平衡解离常数为6.36×10-10M。并且，本专利技术的CD147纳米抗体不仅特异性结合CD147全长而且也结合其C端结构域C87(说明此纳米抗体能够特异性结合CD147C端结构域蛋白)，特异性好。(4)性能稳定，可塑性好。相对于普通抗体或抗体片段，本专利技术所述抗CD147单域抗体仅有一条链因此能够更方便的与效应分子偶联，并且保持稳定的对CD147的结合能力。本专利技术说明书中具体验证了两种方式，通过融合表达与6×Histag共价(肽键)偶联，通过商品化链接试剂与酶标记偶联，两种方式生产的抗体连接产物都具有结合CD147的能力。附图说明通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本专利技术的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：图1是本专利技术实施方式的CD147纳米抗体的氨基酸序列；FR1、FR2、FR3、FR4为四个框架区；CDR1、CDR2、CDR3为三个互补决定区；图2是PHAGE-ELISA实验结果图；横坐标1是阳性对照组,直接包被phage；横坐标2是阴性对照组，包被CD147、结合步骤使用随机噬菌粒；横坐标3是空白对照组，包被PBS、结合步骤使用空噬菌粒；横坐标4是无关对照，包被His标签、结合步骤使用11-1噬菌粒；横坐标5是实验组，包被CD147、结合步骤使用11-1噬菌粒；纵坐标为450nm吸光度值；图3是纳米抗体纯化图；泳道1为蛋白分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗CD147抗体，其含有由SEQ ID NO:3所示的CDR1、由SEQ ID NO:4示的CDR2、以及由SEQ ID NO:5所示的CDR3。

【技术特征摘要】
1.一种抗CD147抗体，其含有由SEQIDNO:3所示的CDR1、由SEQIDNO:4示的CDR2、以及由SEQIDNO:5所示的CDR3。2.如权利要求1所述的抗CD147抗体，其是单克隆抗体、Fab、F(ab)2、Fv、scFv、单域抗体或纳米抗体的一种。3.如权利要求1或2所述的抗CD147抗体，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。4.一种基因，其编码权利要求1-3的任一所述抗CD147抗体。5.如权利要求4所述的基因，其包含SEQIDNO:2的核苷酸序列。6.一种核酸构建体，其包含如权利要求4或5所述基因。7.一种宿主，其包...

【专利技术属性】
技术研发人员：林坚，李日飞，夏斌，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11