本申请提供了与细菌学、免疫学及基因治疗领域相关的方法和制剂。总的来说，提供了用以把疫苗、过敏原和治疗剂导入呼吸道黏膜表面的修饰微生物。尤其是这些制剂和方法旨在诱导Ｍ－细胞介导的针对病原性疾病的免疫反应。特别是公开了疫苗制备、递送以及黏膜免疫法，该方法应用乳酸菌、酵母菌以及与大肠杆菌融合的乳酸菌使源于病原微生物的抗原决定簇展示于细胞表面或者分泌表达，或者分泌一种治疗性蛋白质。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细菌学、免疫学及基因治疗领域。总的来说，本专利技术涉及应用修饰的正常微生物群将疫苗、变应原以及治疗性药物递送至呼吸道黏膜表面。特别是本专利技术为诱导M-细胞介导的对病原体的免疫反应提供了新的药物与方法，尤其是疫苗制备、递送以及黏膜免疫法，该方法应用乳酸菌、酵母菌以及与大肠杆菌融合的乳酸菌使源于病原微生物的抗原决定簇呈现于细胞表面或者分泌表达，或者分泌一种治疗性蛋白质。参考文献 本申请参考了圆括号内所标示的各种出版物或专利，以阐明本专利技术相关领域当前的发展水平。我们通过参考每篇出版物或专利文献而使之成为一体，所引用的全部科学出版文献均列于文中或说明之末。
技术介绍
人体至少存在两个免疫系统“外周”或“全身”免疫系统与“黏膜”免疫系统(Ogra等，1994)，这两系统既可独立又可同时发挥作用，且可通过特定的淋巴细胞调节器而相互作用，产生有效的免疫反应。哪一免疫系统首先发生反应取决于机体获得病理性抗原和由某种淋巴组织处理的方式。有效免疫反应的发生依赖于淋巴细胞相关细胞在血液、组织与淋巴间的持续运动(Anderson与Shaw，1996)。淋巴细胞通过迁移到脾与淋巴结的二级淋巴器官以及Peyer’s小结的特异性黏膜组织来接触经由血液、淋巴或黏膜入侵的外界抗原。抗原在什么地方以及被哪些细胞提呈给这些淋巴细胞极大地影响着免疫反应的结果，这些结果包括T细胞激活，B细胞产生特异性抗体以及将来记忆淋巴细胞和效应淋巴细胞的优先回巢。淋巴流经淋巴结内固定的抗原提呈细胞时，淋巴内的抗原被滤过、捕获、处理与提呈。由淋巴结进行的抗原提呈主要产生“外周”免疫，适宜的B细胞产生特异性IgG或IgM抗体。血液中的抗原在脾内特定的血液/组织界面处被提呈，这主要激发“外周”免疫。然而由于脾脏相容抗原提呈细胞和来自其它各组织的活化T-细胞与B-细胞，这样两系统间的对话就有可能诱发外周免疫或黏膜免疫或者同时产生两种免疫反应。抗原在含腔器官(如呼吸道与胃肠道)的腔内被特殊上皮细胞“M”细胞非破坏性吞饮，并转运至Peyer’s小结内的淋巴细胞。这里发生的抗原提呈反应主要激发“黏膜”免疫反应，释放特异性IgA抗体到黏膜分泌物中。鼻腔、喉咙、肺以及肠腔中的空腔与外界相通，将这些组织暴露于环境中有毒或致病的危险因素。呼吸道、胃肠道以及泌尿生殖道的黏膜表面由一层覆盖有黏液的上皮细胞组成，细胞间通过垫圈样的结构紧密连接一起，起到保护作用。黏膜表面提供了一道富含微生物的细胞屏障，这是病原体与宿主之间的第一个接触面，因而在预防感染性疾病方面至关重要。口腔、咽与食道的上皮层由复层鳞状上皮组成，而上呼吸道的黏膜表面主要由单层简单的上皮细胞排列而成。下呼吸道中的肺上皮细胞对富含病原体的外部环境的抵抗能力较强。这一广阔的细胞屏障由活跃地吸收空气的精细的单层细胞组成，通常情况下能够排斥潜在的有害物质与抗原物质。在呼吸道黏膜上皮层中，有少量的淋巴组织构成了有机的黏膜淋巴滤泡-相关上皮(FAE)组织。尽管大分子物质和微生物不能通过呼吸道的上皮组织侵入，但是在位于上呼吸道的Peyer’s斑这样的黏膜诱导位点中，淋巴FAE含有微褶皱或M细胞，微褶皱或M细胞可以转运抗原及微生物以进行抗原取样。简单上皮内的M细胞仅仅发生于有组织的淋巴滤泡。因而在富含M细胞的FAE位点内，存在特定上皮细胞与抗原提呈细胞及淋巴细胞之间高度发达的协作。通过活跃的跨上皮细胞的小泡转运，M细胞把来自内腔的大分子物质、颗粒以及微生物经由细胞质直接转运到上皮内的黏膜淋巴滤泡和黏膜淋巴组织，以处理抗原，并激发黏膜免疫反应，导致分泌免疫。这一反应使得肺脏黏膜表面浸浴在保护性抗体之中。所以M细胞在上皮屏障中提供了局部的功能性通道以进行小泡转运。M细胞局限于淋巴滤泡(FAE)上，通过及时将外源性物质和微生物暴露于吞噬细胞和抗原提呈细胞，减少了这些物质经由上皮屏障转运的固有危险。M细胞朝向内腔的顶部表面不同于周围的其它细胞它们缺乏典型的刷状缘，而具有变化不定的微绒毛，或具有庞大微绒毛间内吞区域的微褶皱。M细胞的基部内陷形成上皮内的“口袋”或间隙，构成其自身特征。这既缩短了跨细胞囊泡从细胞顶部到基侧部所必须通过的距离，同时又为B细胞和CD4T细胞之类的淋巴细胞、巨噬细胞以及树枝状细胞的聚集提供了停靠位点。M细胞基部还延伸到底部淋巴组织内，与淋巴细胞或/和抗原提呈细胞直接接触，可能对M细胞转运后的抗原提呈发挥作用。M细胞以几种不同的跨细胞方式参与如下过程将外源性物质转运到位于M细胞顶部胞浆中的内体管、囊泡以及大的多囊泡体中去，然后通过胞吐作用将这些物质释放到囊中。粘附性病毒与大分子物质经由网格蛋白小窝与囊泡，通过吸附性胞吞作用被摄取；而非黏附性物质则经由网格蛋白包被或未包被的囊泡，通过液相胞吞作用被摄取。大的黏附性颗粒与细菌能触发吞噬作用，这一过程涉及细胞的延展以及膜下肌动蛋白网的重组。M细胞引导完整的大分子物质由屏障一侧向另一侧转运的功能涉及膜小泡的定向运动。尽管M细胞中这种转运的分子机制尚未明确，但是我们可以有把握地设想M细胞介导的膜转运的完成依赖于极化上皮细胞所具有的特征，即极化的结构和信号传导网络。M细胞的跨上皮小泡转运是物质胞吞作用的主要途径，这使M细胞在上皮细胞中独具特色。研究表明在M细胞顶部表面形成的胞内小泡首先将其运载物运送到顶部细胞浆中的内体，内体含有蛋白酶，并能酸化其内含物。B细胞是M细胞口袋中的主要成分之一，口袋中的B细胞表达IgM而不表达IgG或IgA，提示在这里存在记忆B细胞和/或最初的B细胞分化发生在此。B细胞记忆表型的存在提示口袋内的细胞已为再次暴露于入侵抗原做好了准备。研究表明转移到M细胞口袋中的B淋巴母细胞可以反复暴露于抗原，扩展免疫反应并且使之多样化。但在FAE的正下方，也存在大量足以启动免疫反应的其它B淋巴母细胞、辅助T细胞以及抗原提呈细胞。M细胞跨细胞转运的腔内抗原被直接转运到抗原加工细胞与抗原提呈细胞，这些细胞随后迁移到其下定位于鼻腔相关淋巴组织(NALT)的淋巴滤泡内的抗原特异性淋巴细胞，进一步诱导抗原特异性淋巴细胞的增殖。因此，抗原与微生物通过M细胞的过程是黏膜免疫反应发生的关键步骤。该过程引起产生IgA的B细胞增殖分化，其中部分细胞进入脉管系统，随后返回黏膜表面，有效地激发特异性黏膜免疫。诱导黏膜免疫反应的第一步是将抗原转运通过上皮屏障。抗原在诱导位点加工、提呈后，产生IgA的抗原特异性B淋巴母细胞在局部增殖，并通过血流迁移到局部和远处的黏膜及分泌组织，在这里它们主要分化为产生IgA多聚体的浆细胞，浆细胞是NALT的重要组分，它们经过受体介导的胞吞转运作用，通过上皮细胞进入腺体与黏膜分泌物中。所以，黏膜免疫反应构成了机体防御黏膜传播病原体(如流行性感冒病毒)的第一道防线，并对长期保护起到非常重要的作用。机体对抗病原体的黏膜防御既包括象黏液、上皮组织以及先天性免疫机制之类的先天性屏障，又包括适应性宿主免疫，后者在黏膜表面主要由CD4+T细胞、分泌性免疫球蛋白A(S-IgA)以及抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)组成。在健康状态下，M细胞介导的转运以及由此引起的抗菌性S-IgA的分泌，限制了黏膜疾病的强度与持续时间，并能防止再感染。参与黏膜免疫反应的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在动物体内诱导免疫反应的方法，包括：向实验动物提供按鼻内给药途径设计的免疫原性制剂，其中所述的免疫原性制剂包括带有表达载体的微生物，该表达载体含有编码抗原的异质核酸。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈巍，傅晓丽，雪莉诺莱尼，张智清，
申请(专利权)人：圣必健公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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