本发明专利技术涉及新的核酸构建体，所述构建体在核酸疫苗方案中用于治疗和预防表达ＭＵＣ－１的肿瘤。具体地讲，所述核酸是ＤＮＡ，所述ＤＮＡ构建体包含一个具有少于１０个完全重复单位的编码ＭＵＣ－１衍生物的基因。本发明专利技术还提供包含所述构建体的药用组合物、特别是适于颗粒介导传递的药用组合物、制备它们的方法以及它们在药物中的用途。也提供由所述核酸编码的新的蛋白和含有它们的药用组合物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及新的核酸构建体，所述构建体在核酸疫苗方案中用于治疗和预防表达MUC-1的肿瘤。具体地讲，所述核酸是DNA，所述DNA构建体包含一个具有少于10个完全重复单位的编码MUC-1衍生物的基因。本专利技术还提供包含所述构建体的药用组合物、尤其是适于颗粒介导传递的药用组合物、制备它们的方法以及它们在药物中的用途。也提供由所述核酸编码的新的蛋白和含有它们的药用组合物。
技术介绍
上皮细胞粘蛋白MUC-1(也称为上皮唾蛋白(episialin)或多形性上皮粘蛋白，PEM)是在许多上皮细胞上表达的大分子量糖蛋白。所述蛋白由一个胞质尾、一个跨膜结构域和一个20个氨基酸基序的变数串联重复(在本文称为VNTR单体，也可称为VNTR表位或VNTR重复)组成，所述VNTR重复含有高比例的脯氨酸残基、丝氨酸残基和苏氨酸残基。因为MUC-1基因座上的遗传多态性，重复数目是可变的，最通常在30-100个范围内(Swallow等，1987，Nature 32882-84)。在正常的导管上皮中，MUC-1蛋白仅存在于细胞顶面，向管腔暴露(Graham等，1996，Cancer Immunol Immunother 4271-80；Barratt-Boyes等，1996，Cancer Immunol Immunother 43142-151)。MUC-1分子的最显著特征之一是其广泛存在的O联糖基化。每个MUC-1 VNTR单体中有5个推定的O联糖基化位点。按照以下编号系统，它们是Thr-4、Ser-10、Thr-11、Ser-19和Thr-20。VNTR可以表征为具有如下所示的序列的典型或完全重复序列、或包含与所述20个氨基酸相比有2-3个差异的完全重复序列的小变异下面是所述完全重复的序列。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20A P D T R P A P G STAPPAHGVTSE S TAQ有下划线的氨基酸可以被所示氨基酸残基取代。不完全重复序列对所述共有序列具有不同的氨基酸取代，在氨基酸水平上约有55-90％同一性。4个不完全重复序列如下所示，下划线是取代APDTRPAPGSTAPPAHGVTS-完全重复APATEPASGSAATWGQDVTS-不完全重复1VPVTRPALGSTTPPAHDVTS-不完全重复2APDNKPAPGSTAPPAHGVTS-不完全重复3APDNRPALGSTAPPVHNVTS-不完全重复4野生型MUC-1中的不完全重复邻接完全重复区。在这些上皮细胞瘤性转化引起的恶性肿瘤中，一些改变影响了MUC-1的表达。所述蛋白的极化表达丧失，发现它遍布于转化细胞整个表面。MUC-1的总量也增加了，一般为10倍或10倍以上(Strous & Dekker，1992，CritRev Biochem Mol Biol 2757-92)。最值得注意的是，其O联糖链的数量和质量发生了明显变化。较少丝氨酸残基和苏氨酸残基被糖基化。发现这些糖链异常缩短，产生肿瘤相关糖抗原STn(Lloyd等，1996，JBiol Chem，27133325-33334)。这些糖基化变化的结果是MUC-1肽链上先前被所述糖链遮盖的各种表位变得可及。通过每20个氨基酸VNTR完全单体上存在的序列APDTR(图2中的Ala8-Arg12)，形成一个以这种方式变得可及的表位(Burchell等，1989，Iht J Cancer44691-696)。显然，在MUC-1中的这些变化，意味着能激活针对肿瘤上表达MUC-1形式的免疫系统的疫苗，对上皮细胞肿瘤是有效的，并且甚至对发现MUC-1的其它细胞类型例如T淋巴细胞等也是有效的。免疫系统用来杀伤表达异常蛋白的细胞的重要的效应器机制之一是细胞毒性T淋巴细胞免疫应答(CTL′s)，而这样的应答正是治疗肿瘤的疫苗以及抗体应答所需要的。一个好的疫苗将激活所有武装的免疫应答。然而，目前的糖疫苗和肽疫苗例如癌疫苗(Theratope)或BLP25(Biomira Inc，Edmonton，Canada)优先激活一个武装的免疫应答—分别是体液应答和细胞应答，而较好的疫苗设计最好是产生更平衡的应答。与常规蛋白疫苗相比，核酸疫苗提供许多优势，因为它们容易大量制备。据报道，它们甚至是在小剂量下也能诱导强烈的免疫应答，并能诱导细胞毒性T淋巴细胞免疫应答以及抗体应答。然而，全长MUC-1因其高度重复序列而很难操作，因为它非常容易重组，这样的重组事件给生物制药开发带来很大困难。而且，VNTR区富含GC的特性使测序困难。此外，因为法规的原因—必需充分表征所述DNA构建体。对这样的高频重复结构进行分子测序是非常困难的。如果未能准确了解野生型MUC-1中有多少重复单位，则无法准确表征全长MUC-1，这对获得管理部门的批准来说是不可接受的。认为MUC-1 VNTR区含有优势免疫表位。令人惊奇地的是，本专利技术人发现了能够减少VNTR的数目，从而制备出免疫原性构建体，所述构建体具有与野生型全长MUC-1等同的抗肿瘤活性。本专利技术的构建体是稳定的。具体地讲，在作为大肠杆菌(E.coli)培养物生长了9代、每代持续10-14小时的过程中，所述构建体在生长特征、质粒保留和质粒质量方面是稳定的。专利技术概述本专利技术提供一种编码MUC-1抗原的核酸序列，所述序列能在体内提高免疫应答，并且是稳定的，与全长MUC-1相比降低了重组易发性。稳定性是对以限定形式存在的质粒量的度量。在大规模生长后，用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行测定时，用内眼目测，最好是小于2.0％的重组体污染。通常，大规模是指生长规模大于一升。另有一个对稳定性的独立度量，即质粒拷贝在传代期间保持稳定。质粒拷贝数最好随传代数而增加，尤其是自1-9代开始。优选质粒拷贝数增加约10％、20％、30％、35％、40％，最优选在9代中增加约50％。在具体的实施方案中，本专利技术提供具有1-15个、优选1-10个完全VNTR重复单位的构建体。优选少于8个完全重复。优选的实施方案提供分别带有一个、两个、三个、四个、五个、六个和七个重复的DNA构建体。在本专利技术的某些实施方案中，保留了所述不完全重复区。优选含有一个或七个完全重复的构建体。由所述构建体编码的蛋白是新的，构成本专利技术的一个方面。在本专利技术的另一方面，所述核酸序列是呈质粒形式的DNA序列。优选所述质粒是超螺旋的。在本专利技术的另一方面，提供一种包含本文所述核酸序列和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的药用组合物。所述载体最好是金珠，而所述药用组合物最好能通过颗粒介导递药而传递。在又一个实施方案中，本专利技术提供用于药物的药用组合物和核酸构建体。具体地讲，提供本专利技术的核酸构建体，以制备用于治疗或预防表达MUC-1的肿瘤的药物。本专利技术还通过给予安全有效量的本文所述组合物或核酸，提供一种治疗患有或易患表达MUC-1的肿瘤的患者的方法，所述表达MUC-1的肿瘤尤其是乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌(尤其是非小细胞肺癌)、胃癌和其它GI(胃肠)癌。在又一个实施方案中，本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码ＭＵＣ－１抗原的核酸分子，所述分子能提高体内免疫应答，并且具有比全长ＭＵＣ－１降低的重组易发性。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：N博登，JH埃利斯，PA汉布林，
申请(专利权)人：葛兰素集团有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]
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