不含异源成分的gM-阴性EHV突变体制造技术

本发明专利技术涉及动物健康领域，特别是涉及编码ｇＭ蛋白的基因缺失且不含异源成分的马疱疹病毒（ＥＨＶ）。本发明专利技术进一步涉及包含所说病毒的药用组合物及其应用，以及预防和治疗ＥＨＶ感染的方法。本发明专利技术也涉及包含ＥＨＶ－１和ＥＨＶ－４病毒的药用组合物，其中编码ｇＭ蛋白的基因缺失，并且不含有异源成分。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物健康领域，特别是涉及编码gM蛋白的基因缺失且不含异源成分(heterologous element)的马疱疹病毒(Equine Herpes Viruse)(EHV)。本专利技术进一步涉及包含所说病毒的药用组合物及其应用，以及预防和治疗EHV感染的方法。本专利技术也涉及包含EHV-1和EHV-4病毒的药用组合物，其中编码gM蛋白的基因缺失，并且不含有异源成分。
技术介绍
马疱疹病毒1(EHV-1)，作为α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)的成员，是马中病毒引起流产的主要原因，它也可引起呼吸和神经系统疾病。马疱疹病毒4(EHV-4)也可引起呼吸系统疾病，流产，或神经系统疾病。已经鉴定出了两种类(EHV-1菌株Ab4p；EHV-4菌株NS80567)的DNA全序列(Telford，E.A.R.et al.，1992；Telford，E.A.R.et al.，1998)。然而，只鉴定出了少数与EHV毒力和免疫原特性相关的基因和基因产品。疱疹病毒的糖蛋白，在病毒感染初期阶段，病毒粒子的细胞释放阶段，以及病毒粒子通过与相邻细胞融合而进行细胞至细胞的直接扩散阶段，都扮演了至关重要的作用。迄今为止，已经鉴定出了11种1型单纯疱疹病毒(HSV-1)编码的糖蛋白，它们命名为gB，gC，gD，gE，gG，gH，g1，gJ，gK，gL和gM。缺失了gC，gE，gG，g1，gJ，和gM的HSV-1突变体是活的，显示这些基因在培养细胞中对病毒复制是可有可无的。HSV-1和马疱疹病毒1的核苷酸序列比较显示，所有的已知HSV-1糖蛋白在EHV-1中都是保守的。按照当前的命名法，这些糖蛋白被以它们的HSV-1同源类似物的名字命名。已知EHV-1的gC，gE和g1不是在细胞培养物中生长所必需的，而gB和gD则是病毒在培养细胞中生长所必需的。其它EHV-1糖蛋白对在培养细胞中病毒复制所起的作用是未知的(Flowers，C.C.et al.，1992)。转录和蛋白分析显示，糖蛋白gB，gC，gD，gG，gH和gK可在EHV-1感染的细胞中表达。糖蛋白gM(由基因UL10表达)是唯一报道的非必要糖蛋白，其在所有的疱疹病毒亚家族中是保守的，并且对于人、小鼠巨细胞病毒，以及γ疱疹病毒亚科成员EHV-2，松鼠猴疱疹病毒(herpesvirus saimiri)，以及EB病毒(Epstein-Barr)有记载。与许多疱疹病毒糖蛋白类似，HSV-1 gM在病毒粒子和感染细胞的膜上出现。只缺失gM的HSV-1突变体在细胞培养系统中的生长滴度，与野生型病毒相比，大约减少了10倍，而且在小鼠模型中显示出了减少的毒力(Baines，J.D.et al.，1991；MacLean，C.A.et al.，1993)。EHV-1 gM同源类似物(gp21/22a；本文中称为EHV-1 gM)第一次是被Allen和Yeargan(Allen，G.P.et al，1987)所记载，认为其是病毒包膜的主要成分。进一步的研究显示，基因52是与HSV-1 UL10同源的基因，编码450个氨基酸的EHV-1 gM多肽(Pilling，A.et al.，1994；Telford，E.A.R.et al.，1992)。EHV-1 gM是一个多聚体疏水蛋白，包含有8个预测的跨膜区，据报道在感染细胞和纯化病毒粒子中出现，是Mr为45,000的蛋白(Pilling，A.et al.，1994；Telford，E.A.R.et al.，1992)。为了控制EHV-1的病毒感染，可以采取两种不同的方法。第一种，开发修饰的活疫苗(MLVs)，包括广泛在欧洲和美国中使用的RacH株(Mayr，A.etal.，1968；Hubert，P.H.et al.，1996)。第二种，灭活疫苗，以及基于重组表达的病毒糖蛋白亚单位疫苗，如糖蛋白(g)B，C，D，和H，它们可对接下来在模型鼠中EHV-1的感染接种产生部分的保护作用。包含所说糖蛋白的亚单位疫苗，如gB，gC，gD，和gH，只有很弱的抗重复感染的保护作用(Awan et al.，1990，Osterrieder et al.，1995，Tewari et al.，1994，Stokes et al，1996)。本专利技术要解决的技术问题是，提供一种比现有技术疫苗能更好抗EHV感染的改良疫苗。附图说明图1不含外源序列的gM缺失EHV-1 RacH病毒(HΔgM-w)的构建此图显示了病毒的基因图，和用于构建HΔgM-w的质粒。通过插入大肠杆菌lacZ(HΔgM-lacZ)表达框或绿色荧光蛋白(GFP)表达框(HΔgM-GFP)，首先构建“第一代”HΔgM病毒。图A显示了EHV-1 RacH株的BamH1图谱，包含gM-ORF的BamHI-HindIII片段在图B中被放大了，显示出了该区域的基因组结构。gM缺失病毒-HΔgM-GFP，携带有取代了EHV-1 gM基因主要部分的GFP表达框。图C记载了在Southern印迹中使用的GFP特异性探针。质粒pBH3.1携带有EHV-1 BamHI-HindIII目标片段，它用于构建质粒pXuBaxA。HΔgM-GFP的DNA与质粒pXuBaxA共转染，得到HΔgM-w(图D)。限制性位点BamH1-B，Hind111-H，Sph1-S，Hinc11-Hc，Apa1-A，Pst1-P图2不含外源序列gM缺失的EHV-1病毒(HΔgM-w)的Southern印迹将RacH毒株，HΔgM-GFP，以及HΔgM-w的DNA用BamH1，HindIII，或Pst1裂解，然后用GFP-特异性探针(GFP)或pBH3.1的EHV-1BamHI-HindIII片段进行分析(pBH3.1)。使用CSPD借助化学发光检测DNA杂交体。分子量标记蛋白的分子量大小(Biolabs)在左侧空白处以kbp大小给出。在箭头所指处，特异性杂交体几乎是不可见的。图3不含外源序列的gM缺失的EHV-4病毒的构建(E4ΔgM-w)本图中，描述了EHV-4 NS80567株的BamH1图谱。在放大图中，BamH1-e片段包括gM和邻近的ORFs(A)。图B描述了质粒构建体和引物位点。质粒pgM4GFP+用于构建E4ΔgM-GFP，即GFP是阳性且gM是阴性的EHV-4(B，C)。将E4ΔgM-GFP与包含3.109bp大小EHV-4序列、包含gM-ORF的质粒pgM4R(B)进行DNA重组，可获得E4RgM，即gM修复的(gM-repaired)EHV-4(A)。或者将E4ΔgM-GFP与质粒pgM4w(B)进行DNA重组，可获得E4ΔgM-w，即GFP和gM都是阴性的EHV-4(D)。限制性位点BamH1-B，Pst1-P，EcoRI-E，Sa11-Sa，Mlu1-M，Asn1-As，EcoRV-EV图4不含外源序列的gM缺失的EHV-4病毒的Southern印迹(E4ΔgM-w)如图所示，将EHV-4，E4RgM，E4ΔgM-w和E4ΔgM-GFP的DNA用Pst1，EcoRV或HindIII裂解，获得的DNA片段印迹至尼龙膜上。将平行膜与GFP特异性序列杂交，或者将平行膜与称为gM3.1的探针杂交，g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白ｇＭ缺失的马疱疹病毒（ＥＨＶ），其特征在于所述ＥＨＶ不含异源成分。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼纽鲍尔，克里斯蒂娜齐格勒，
申请(专利权)人：贝林格尔英格海姆维特梅迪卡有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]