栉孔扇贝G型溶菌酶基因和编码蛋白及其克隆方法技术

本发明专利技术涉及Ｇ型溶菌酶，特别是栉孔扇贝Ｇ型溶菌酶基因和编码蛋白及其克隆方法；栉孔扇贝Ｇ型溶菌酶基因，具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．１所示的碱基序列，其编码蛋白具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．２所示的氨基酸序列。本发明专利技术克隆到的栉孔扇贝Ｇ型溶菌酶基因有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，该基因在扇贝免疫防御方面具有重要功能，可用于溶菌酶的重组表达和基因转移，并为栉孔扇贝的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及G型溶菌酶，特别是栉孔扇贝G型溶菌酶基因(cDNA全序列和氨基酸序列)及从栉孔扇贝cDNA中克隆出栉孔扇贝溶菌酶的克隆方法。
技术介绍
溶菌酶是由弗莱明在1922年发现的(Proc.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.1922)。该酶全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，能水解细菌细胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4-糖苷键，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解，故又称胞壁质酶，即N-乙酰胞壁质糖苷聚糖水解酶。有些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌、伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。溶菌酶是一种广泛存在于自然界动物、植物和微生物中的小分子碱性蛋白，在机体中起非特异防御机制。正是用于溶菌酶的抗菌作用，无论在工业还是医学上都具有重要的应用价值。首先溶菌酶可药用，具抗菌、清除局部坏死组织、止血、消肿、消炎及恢复组织功能等作用，在医学上可用来制消炎药等。在食品工业上可用作防腐剂，还可添加在牙膏中作为防治龋齿的药用牙膏。在发酵工业上是一种重要的溶菌剂，用于存作细胞壁，制备无菌体提取液。溶菌酶可分为四型c型(鸡卵清溶菌酶，chicken egg-white lysozyme，cly)、g型(鹅卵清溶菌酶，goose egg-white lysozyme，gly)、i型(invertebratelysozyme)、噬菌体溶菌酶。大部分溶菌酶都属于c型，cly由130个氨基酸残基组成，相对分子质量为14700。gly最早是由Jolles和Canfield发现的，约含有185个氨基酸残基，相对分子质量为21000。Olsen，Nilson等报道的贝类i型溶菌酶与c型溶菌酶有一定的同源性。噬菌体溶菌酶位于各种噬菌体内，对溶解宿主菌起重要作用，它含有164个氨基酸残基，相对分子质量为18700。目前在无脊椎动物中还没有g-溶菌酶的报道，相关海洋生物报道的有Savan报道的鲤鱼g-lysozyme，Rogerio报道的白虾c-lysozyme，FengLiu报道的斑马鱼c-lysozyme，Hikima报道的牙鲆g-lysozyme，以及Olsen，Nilson等报道的与cly具有同源性的贝类i-lysozyme。溶菌酶在海洋贝类抵御病原菌感染中扮演重要的角色，并且由于其此独有的低温、高盐作用环境可使之区别于现有的哺乳动物溶菌酶，具有重要的应用前景，它可应用于海洋生物医药、海洋生物免疫、水产品低温保存和运输等不同领域。
技术实现思路
本专利技术利用构建cDNA文库、EST分析、3’和5’RACE技术，对栉孔扇贝G型溶菌酶基因进行了研究，首次从栉孔扇贝中克隆到G型溶菌酶基因，该基因可以用于溶菌酶基因的体外重组表达和基因转移，为医药产品开发、扇贝免疫学研究、遗传选育和改良、病害防治以及保鲜品和防腐剂的开发奠定了基础。本专利技术从栉孔扇贝中克隆到G型溶菌酶基因，它具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列；其编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。从栉孔扇贝中克隆到G型溶菌酶基因的方法包括(1)栉孔扇贝总RNA的提取及mRNA的纯化；(2)栉孔扇贝cDNA文库构建；(3)栉孔扇贝cDNA文库EST序列的大规模测定；(4)栉孔扇贝EST序列的同源性分析及栉孔扇贝G型溶菌酶基因片段的筛选；(5)用基因特异性引物CFLyzF 5′-CATCCGCTACCACTCCTGTC-3′和CFLyzR 5’-CAACTACGTCATTGCTGTAGTC-3’进行3’和5’RACE克隆到栉孔扇贝G型溶菌酶基因cDNA全长序列。所述的栉孔扇贝总RNA的提取是从感染了鳗弧菌的栉孔扇贝血淋巴中提取总RNA。本专利技术克隆得到的栉孔扇贝G型溶菌酶基因，该基因cDNA全长829bp，有一个600bp的开放阅读框，编码200个氨基酸，5’非编码区长21bp，3’非编码区长208bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴；该基因在扇贝免疫防御方面具有重要功能。本专利技术利用表达序列标签(EST)技术、cDNA 3’和5’快速扩增技术(RACE)从栉孔扇贝中克隆到G型溶菌酶基因，可用于溶菌酶的重组表达和基因转移，并为栉孔扇贝的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品奠定基础。所制得的栉孔扇贝G型溶菌酶基因的序列可在栉孔扇贝遗传选育中的应用；也可在细菌、酵母和昆虫细胞系中的表达；同时其重组表达产物也可在药物生产、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中的应用。具体实施例方式实施例1.一种克隆得到的栉孔扇贝G型溶菌酶基因，具有以下序列(1)序列表中SEQ ID NO.1的信息序列特征长度829碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线形来源栉孔扇贝(Chlamys farreri)序列描述GCACGAGGCTAGATTCCAACGATGAACCCACTGGCAGTACTCACACTTCTTGCTATCAGCACTGGTGCCTGGGCAGCGTCCTACACCTGCCATGGTGACGTCACACGACTTCATCCCCATGGACAACACAATAGAGGTGTCGCTGCATCCAACCGTGGCGTAGATTACGATTACCATGACCTGTTAGCCAAGAAAAGTTGTTACGAAGCATCAGGCGCACGACACTGTATTCAGCCGTCTGTGATTGCCGCCTTGGCCAGTCGAGAATCACGTGGAGGGCGTCTTCTGACGTCAACAGGAGGATGGGGAGATCATCACCATGCCTACGGTATATTACAGTGTGACATCCGCTACCACTCCTGTCAGCAGTACGCTTGGAACAGTTGTGAACACATAGAACAAATGGTGAAGGAGGTCCTTGTGGCATACATCGGTCAGGTGGCGCGTAAACATCCCACGTGGTCACGAGATCAGCAACTCCAAGGTGGTATCGCCGCCTACAACTCCGGAGTTGGCAACGTCCAGACCTGGGCCCACCTCGACGTCGGCACAACCGGAAATGACTACAGCAATGACGTAGTTGCGCGTGCTAAACACCTTATTTCAAGCCACGGCTGGCATTAAATGCGATTAAGCACGAAAGAGAGCCACCCATGCTAATTTCAAGATATAATATTCAAAAGAGCGATATTTTTACTTTGAAGAGATAATCGTTTTAAGGACAGGACATAGAAATCATGCATTGTTGGTAATGGCTTGCATATTACAGTAATAAACGGTTGTACTAATGTTCTTCAAAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(2)序列表SEQ ID NO.2的信息序列特征长度200个氨基酸类型氨基酸链型单链拓扑结构线形来源栉孔扇贝(Chlamys farreri)序列描述MNPLAVLTLLAISTGAWAASYTCHGDVTRLHPHGQHNRGVAASNRGVDYDYHDLLAKKSCYEASGARHCIQPSVIAALASRE本文档来自技高网...

【技术保护点】
栉孔扇贝Ｇ型溶菌酶基因，其特征在于：具有ＳＥＱＩＤＮＯ．１所示的碱基序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋林生，邹慧斌，胥炜，相建海，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]