超量产酶的转基因微生物制造技术

本发明专利技术涉及一株经转化后超量产生α－半乳糖苷酶的里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）。通过设计的ＰＣＲ引物把α－半乳糖苷酶基因与纤维二糖水解酶基因的启动子和终止子相连，以便α－半乳糖苷酶能表达并从微生物中分泌出来。转化的微生物发酵培养后将α－半乳糖苷酶释放到上清液中，其酶活至少为２０ＩＵ／ｍｌ。用大豆壳作为诱导物可以增加α－半乳糖苷酶的产量。上清液过滤浓缩后得到的液体产品可以添加到饲料和食品中，提高生物转化率。液体浓缩物也可以进行干燥，如喷雾干燥，以得到α－半乳糖苷酶干粉，这样可以延长产品的保质期。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
本专利技术广泛涉及超量产酶的转基因微生物，更具体地说，本专利技术涉及超量产酶、特别是α-半乳糖苷酶的里氏木霉(Trichoderma reesei)(有时也被称作长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum))遗传转化体。在欧洲和亚洲，根据动物饲料中所含谷物的种类添加不同的水解酶，这样做不仅可以提高饲料的转化率，还可增加牲畜加工后的利润，具有很强的商业可行性。添加的水解酶能够分解单胃动物不能完全消化的饲料中的复杂物质，如纤维素，半纤维素，植酸盐和α-半乳糖苷。有人曾尝试用大规模培养转基因生物的方法来生产大量的酶，而且分子和发酵技术也被用来开发可提高人和动物营养的具有附加值的蛋白质/酶产品。除这些技术外，本专利申请书还描述了获得高产酶的转基因微生物所需的几个基因表达盒的构建过程。许多真细菌和真菌都分泌水解酶来分解它们周围环境中的复杂分子，产生更小的、更易被同化吸收的物质来供其生长所用(Coughlan，M.P.and L.G.Ljungdahl.1988.Comparative biochemistryof fungal and bacterial cellulolytic enzyme systems，11-30.In J.-P.Aubert，P.Beguin，and J.Millet(ed.)，Biochemistry and Genetics ofCellulose Degradation.Academic Press，San Diego，USA；Leschine，S.B.1995.Cellulose degradation in anaerobic environments.Annu.Rev.Microbiol.49399-426)。用传统的遗传技术对自然界存在的野生菌株进行改造，得到的高产酶突变体已经在食品，饲料，纺织，烘烤和日用化学品工业中得到了商业应用(Eveleigh，D.E.and B.S.Montenecourt.1979.Increasing yields of extracellular enzymes.Adv.Appl.Microbiol.2557-74；Ghosh，A.，B.K.Ghosh，H.TriminoVazquez，D.E.Eveleigh and B.S.Montenecourt.1984.Cellulase secretion from ahypercellulolytic mutant of Trichoderma reesei RUT-C30.Arch.Microbiol.140126-133；Nieves，R.A.，C.l.Ehrman，W.S.Adney，R.T.Elander and M.E.Himmel.1998.Technical communicationsurvey andanalysis of commercial cellulase preparations suitable for biomassconversion to ethanol.World J.Microbiol.Biotechnol.14301-304)。用传统遗传学技术改造的丝状真菌菌株所产生的蛋白量可以超过40g/升培养液，但其分泌的水解酶的性质和比例却没有显著的改变。而用分子生物学技术改造的菌株却可以从本质上对酶进行修饰，并且能够表达异源的基因(Harkki，A.，A.Mantyla，M.Penttila，S.Muttilainen，R.Buhler，P.Suominen，J.Knowles and H.Nevalainen.1991.Geneticengineering of Trichoderma to produce strains with novel cellulaseprofiles.EnzymeMicrob.Technol.13227-233；van Gorcom，R.F.，M.，P.J.Punt and C.A.M.J.J.van den Hondel.1994.Heterologous geneexpression inAspergillus，241-250.In K.A.Powell等(ed.)，The GenusAspergillus.Plenum Press，New York，USA)。特别是里氏木霉的cbhl(纤维二糖水解酶I)基因的强启动子已被广泛用于同源和异源表达系统中，驱动转基因的表达(Keranen，S.and M.Penttila.1995.Production of recombinant proteins in the filamentous fungusTrichoderma reesei.Curr.Biol.6534-537)。一个基因序列的精细结构特征，mRNA的稳定性和翻译效率，密码子选择的偏好，蛋白质折叠，宿主细胞蛋白酶对蛋白的降解和过量表达的蛋白对宿主的毒性都给目的蛋白的表达带来不可预知的负面影响。细胞生长特性，基因表达水平，胞内或分泌表达以及翻译后修饰也会影响细胞过量表达具有生物活性的重组蛋白的能力，而且这种影响不易预测与控制。特别是在某个特定的宿主细胞中过量表达一种特殊的蛋白时，重组DNA元件(cassette)的设计和构建就成为成功的主要决定因素(Makrides，S.C.1996.Strategies for achievinghigh-level expression of genes in Escherichia coli.Microbiol.Rev.60512-538)。在特定宿主细胞中表达特殊的目的蛋白所需的重组基因表达盒必须包括以下几个遗传组件1)转录调节部分(启动子和终止子)；2)核糖体结合和翻译起始位点；3)蛋白质定位，在胞浆还是分泌到培养基中；4)用来挑选转化子的标记基因(Makrides，ibid.)。重组基因的高水平转录是重组蛋白高效表达所必需的。用高活性的启动子代替基因原来的内源性启动子可使蛋白的表达水平提高几倍。对转录过程的调控也有利于蛋白的表达，但却不是必需的。此外，在重组蛋白的N-末端加一个可切割的分泌信号可以使目的蛋白分泌到培养基中，从而简化蛋白的回收过程。抗生素抗性标记经常用作转化子筛选的遗传标记，但是考虑到人体致病菌中的抗性基因可能会因此而广泛传播，因此人们就开发了基于营养缺陷型突变株互补性的遗传标记。本专利申请书中所描述的表达盒利用了里氏木霉的cbh1基因的强启动子(包括Cbh I蛋白的信号肽序列)和终止子，并将它们连接到里氏木霉agl1(α-半乳糖苷酶)基因上。大肠杆菌的hph(潮霉素磷酸转移酶)基因也通过基因技术连接到表达盒上作为筛选标记(Carroll，A.M.，J.A.Sweigard and B.Valent.1994.Improved vectors for selectingresistance to hygromycin.Fungal Genet.Newsl.4122)。本专利申请书还描述了电穿孔(electroporation)作为一种遗传转化方法在基因导入并与宿主基因组整合中的用途。将外源DNA导入细胞的基因转移系统的发展本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的丝状真菌，其表达的α－半乳糖苷酶的量比野生型菌株里氏木霉ＲＵＴ－Ｃ３０至少高５倍。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：唐纳德M小马特森，弗里德黑尔姆布林克豪斯，兰迪L彼得斯，史蒂文西姆比耶达，米歇尔P穆尔，努格扎尔N纳特西比德兹，
申请(专利权)人：凯敏工业公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]