本发明专利技术公开了一个与小麦籽粒硬度相关的基因及其编码蛋白与应用，其目的是提供一个与小麦籽粒硬度相关的基因及其编码蛋白与其在小麦籽粒品质改良中的应用。该小麦籽粒硬度相关基因，具有下述核苷酸序列之一：１）序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：２的多核苷酸；２）编码序列表中ＳＥＱ ＩＤ №：１多肽序列的ＤＮＡ；３）在高严谨条件下可与序列表中的ＳＥＱ ＩＤ №：２限定的ＤＮＡ序列杂交的核苷酸序列。本发明专利技术的Ｐｉｎｂ－Ｄｌｑ突变型小麦的籽粒硬度同Ｐｉｎｂ未发生突变的同品种小麦相比有较大提高，对小麦籽粒硬度的基因工程改良将起到重要作用，同时也有助于小麦籽粒硬度的遗传和分子生物学的进一步研究，对优良小麦品种的培育也具有重大意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一个与小麦籽粒硬度相关的基因及其编码蛋白与其在小麦品质改良中的应用。
技术介绍
籽粒硬度是小麦品质的重要性状之一，它影响小麦的出粉率、面粉颗粒大小、润麦加水量、破损淀粉粒数量和最终的食品加工品质等，是市场上对其进行分级、定价的重要依据。按胚乳质地可把普通小麦分为硬质麦、混合麦和软质麦。籽粒硬度主要由位于染色体5D短臂(5DS)上的主效基因Pina和Pinb(统称为puroindoline)控制。1986年，Greenwell和Schofield从小麦籽粒中提取出一组分子量约为15kD的蛋白多肽，命名为friabilin蛋白，大大推进了分子水平上籽粒硬度的研究进程。研究表明，Puroindoline蛋白是friabilin蛋白的主要成分，是决定小麦籽粒硬度的基础，主要由两种蛋白组分puroindoline a(PINA)和puroindoline b(PINB)组成，其编码基因分别命名为Pina和Pinb。PINA蛋白缺失或编码PINB蛋白的基因(Pinb)发生突变均可造成小麦胚乳质地变硬。Giroux等对两个硬麦品种进行研究，发现Pinb基因中有一位点发生了突变，导致相应氨基酸序列中第46位的Gly变为Ser，将此突变类型命名为Pinb-D1b。此后，相继有多种硬度突变类型被发现。Lillemo和Morris发现了Pinb基因两种新的突变类型，一个是第60位的Leu变为Pro，将此突变类型命名为Pinb-D1c，另一个是第44位氨基酸由Trp变为Arg，将此突变类型命名为Pinb-D1d。Morris等发现，在一种硬红春小麦的Pinb基因中第39位氨基酸Trp突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-D1e；在一种硬红冬小麦的Pinb基因中第44位氨基酸Trp突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-Dif；在另一种硬红冬小麦的Pinb基因中第56位氨基酸Cys突变为终止密码子，将此突变类型命名为Pinb-D1g。最近，Massa等在山羊草中新发现了六种Pina基因和四种Pinb基因的等位变异，但均表现为软质。Xia等经研究发现Pinb-D1b是我国小麦中最为常见的硬度变异类型，并在农大3213和农大3395等10个品种(系)中发现Pinb基因中相应于第42位氨基酸有一碱基A缺失的新变异类型，将其命名为Pinb-D1p。有关Pinb基因及其突变型的总结如表1所示表1 已知的Pinb基因的表现型、突变类型、分子变化及参考文献
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个与小麦籽粒硬度相关的基因及其编码蛋白。本专利技术所提供的与小麦籽粒硬度相关的基因，名称为Pinb-D1q，来源于小麦，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的DNA；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。序列表中的SEQ ID №2由447个碱基组成，其编码框为自5’端第1到第444位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质；与未发生突变的Pinb的编码基因相比，它的核苷酸序列自5’端第218位碱基由g变成了t，使Ser的密码子TGG突变成了Leu的密码子TTG。本专利技术所提供的与小麦籽粒硬度相关基因的编码蛋白，名称为PinB-D1q，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与小麦籽粒硬度相关的蛋白质。序列表中的SEQ ID №1由148个氨基酸残基组成，与野生型Pinb-D1a相比，其氨基酸序列第44位由Ser突变为Leu，同时，突变后的Pinb基因不再表达friabilin蛋白，由此而导致小麦籽粒SKCS硬度提高。含有上述与小麦籽粒硬度相关基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增小麦籽粒硬度相关基因中任一片段的引物也属于本专利技术的保护范围。不同硬度基因的变异类型对籽粒硬度影响不同，本专利技术的Pinb-D1q突变型小麦的籽粒硬度同Pinb未发生突变的同品种小麦相比有较大提高。因此，Pinb-D1q对小麦籽粒硬度的基因工程改良将起到重要作用，对优良小麦品种的培育也具有重大意义。利用该品种和其它品种小麦得到的不同专用类型的面粉，可以满足各种小麦制品的需要，同时也有助于小麦籽粒硬度的遗传和分子生物学的进一步研究。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生物工程公司合成。实施例1、小麦Pinb-D1q的获得及Puroindoline基因型分析小麦材料选择由北京农林科学院培育、2002年审定的优质小麦品种京冬11，其亲本为长丰3号/041//京冬6号。该品种具有优良的面条特性。一、籽粒硬度测定将京冬11小麦样品在同一条件下放置3d，使小麦籽粒的含水量控制在11-13％之间。用单粒谷物硬度仪(SKCS 4100，瑞典Perten公司)测定300粒小麦样品的硬度值，根据测定结果确定籽粒的硬度级别，同时记录千粒重和籽粒直径。籽粒硬度值小于40多为软质麦，大于60多为硬质麦，介于40和60之间者多为混合麦。SKCS分析结果表明，京冬11的SKCS硬度指数(±标准差)和分布分别为51±12和07-22-45-26，级别分类为3级，属于混合麦，其中偏软和偏硬的籽粒均有较大分布。二、小麦Pinb-D1q的获得对步骤一经SKCS分析的京冬11小麦样品中的puroindoline(包括PinA和PinB)进行分析，具体方法包括以下步骤 1、提取小麦籽粒基因组DNA选取一粒硬质有代表性的种子(将其切割后根据其角质率判断是否与SKCS分析结果吻合)，提取小麦籽粒基因组DNA，具体方法为1)用锤子砸碎后放入1.5mL离心管中，加入1mL样品提取液(含288mM NaCl，200mM Tris-HCl，25mM EDTA，0.5％SDS)，摇30分钟，使其充分混匀；2)在4℃、12,000rpm下离心15分钟，移上清至另一2mL离心管中，加入等体积的酚/氯仿(1∶1)；3)12,000rpm离心15分钟，移上清至另一2mL离心管中，加入0.5倍上清体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，充分摇匀；4)12,000rpm离心10分钟，移上清至另一新的2mL离心管中，加入1/10体积的3M NaAC(pH＝5.2)和0.6倍上清体积的异丙醇沉淀DNA，轻轻混匀；5)12,000rpm离心15分钟，弃上清，加入0.5mL 70％乙醇，静置5min；6)12,000离心5min，弃上清。真空干燥后加入100μL TE溶解沉淀，沉淀即为小麦籽粒基因组DNA。最后，用紫外分光光度计检测小麦籽粒基因组DNA的浓度，-20℃下保存备用。2、用PCR方法鉴定京冬11的硬质小麦是否为Pinb-D1b突变型鉴定京冬11的硬质小麦是否为Pinb-D1b变异类型，即检测Pinb基因的第46位点是否由甘氨酸的密码子(GGC)变为丝氨酸的密码子(AGC本文档来自技高网...
【技术保护点】
小麦籽粒硬度相关基因，具有下述核苷酸序列之一：１）序列表中ＳＥＱＩＤ№：２的多核苷酸；２）编码序列表中ＳＥＱＩＤ№：１多肽序列的ＤＮＡ；３）在高严谨条件下可与序列表中的ＳＥＱＩＤ№：２限定的ＤＮＡ序列杂交的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何中虎，陈锋，夏先春，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物育种栽培研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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