一种调控叶绿素代谢的关键基因及其创建植物滞绿性状的方法技术

叶片中叶绿素降解的减缓可以显著地延长叶片的自然衰老和离体衰老进程，进而可能延长光合期和光合总量；因此而导致的滞绿性状（ｓｔａｙ－ｇｒｅｅｎ）可以延长绿叶蔬菜的货价寿命和饲料作物的采后绿期，进而增加其主要营养成分叶绿素和蛋白质的含量；滞绿性状也可以显著地改善草坪植物的绿期和景观效果。本发明专利技术是以快中子诱变模式植物拟南芥，筛选获得了滞绿突变体，通过图位克隆的途径分离获得了叶绿素降解代谢的关键调控基因ＡｔＮＹＥ１。运用ＲＮＡ干扰或其它技术，借助于基因工程的手段，通过变异ＮＹＥ１基因，或抑制该基因的表达，以及降低ＮＹＥ１蛋白活性等，创造植物滞绿性状。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及是一种在植物正常衰老进程中叶绿素降解代谢调控、导致叶片变黄的新颖基因AtNYE1。利用RNAi技术抑制该基因表达，或通过快中子诱导该基因变异，使该蛋白的活性降低或失活，从而获得滞绿的植物性状。
技术介绍
植物叶片进入衰老程序后，由于叶绿素的快速降解所导致的黄化现象，是几乎所有植物叶片衰老的共同、也是最显著的表观特征。虽然叶片衰老可以被许多环境因子和发育因子诱导，但是叶片衰老开始的时间以及过程都是被细胞凋亡过程所调控。在过去数十年中，学者们在许多作物上发现了叶片绿期延迟至成熟或衰老之后，即滞绿(stay-green)或非黄化(non-yellowing)突变体。根据Thomas，H和Howarth，C.J.(J.Exp.Bot.，51329，2000)的分类，滞绿突变体可以分为五种基本类型。A型滞绿突变体的衰老启动推迟，但是衰老的速率不变；B型滞绿突变体衰老启动正常，但是叶片黄化和光合速率下降减缓。由于这两类滞绿突变体的光合期被延长，因而被称之为“功能型”滞绿。C型滞绿突变体中叶绿素降解功能由于遗传变异导致的异常，叶绿素含量可以长期维持不变；但是，就生理功能退化而言，与野生型无异。因此该类突变体被称之为“非功能型”滞绿，或“表观”滞绿。D型滞绿突变体是由于速冻或骤干所引起的叶片死亡所致。最后一种为E型突变体，在该种突变体内积聚过量的叶绿素，使得叶片呈深绿色，但光合效率维持不变。D型、E型与C型一样，也为“非功能型”滞绿。迄今为止，研究得最广泛、最深入的滞绿突变体是草地羊毛(Festuca pratensis)滞绿突变体及其衍生遗传材料(Thomas，H.，Planta，13753，1977；Thomas，H.，Planta，154212，1982；Thomas，H.，Theor.Appl.Genet.，73551，1987；Thomas，H.& Matile，P.，Phytochemistry，27342，1988)。该突变体是一种自然发生的变异体，受核内单隐形位点(sid)的调控；属于非功能型突变。与野生型相比，在衰老叶片中有明显的脱植醇叶绿素酸酯、羟基叶绿素酸酯和脱镁叶绿酸的积累；而且，叶绿素捕光结合蛋白(light harvest chlorophyll-binding protein)的稳定性也显著地增加。但是，可溶性蛋白，特别是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)大亚基的降解速率没有差异。衰老诱导三天后，突变体中脱镁叶绿酸氧化酶(Phaeophorbide aoxyginase)活性只是野生型中的12％，说明突变体中叶绿素降解受阻于脱镁叶绿酸的开环(Roca，M.，et al.，Phytochemistry 651231-1238，2004)。在大豆中，滞绿性状受到三个核基因(G和dld2)和一个胞质基因(cytG)的控制(Guiamet，J.J.，et al.，Plant Cell Physiol.，311123，1990)。一个显性基因G使种皮维持绿色。一个胞质基因，cytG和两个隐性基因，dldld2d2和G_dldld2d2调控叶片、果荚、种皮和胚中的绿色色素。据报道，cytG的突变可使得衰老叶片中的叶绿素b比叶绿素a更加稳定，因而抑制了叶绿素的降解。dldld2d2纯合突变可使衰老叶片中叶绿素和可溶性Rubisco蛋白的降解显著延迟(Guiamet，J.J.et al.，Plant Physiol.，96227，1991；Guiamet，J.J.et al.，Physiol.Plant.，96655，1996)在干菜豆(Phaseolus vulgaris)的滞绿突变体中，也报道了衰老叶片中叶绿素滞留的现象(Backmann，A.et al.Biochem.Bioph.Res.Co.2031362-1362，1994)。但是，在突变体中既没有发现叶绿素酶活性的改变，也没有检测到脱镁叶绿酸的积累。然而，相比于野生型，突变体中的叶绿素酸酯a和b的确有积累，表明脱镁螯合酶活性可能存在缺陷(Fang，Z.，et al.J.Exp.Bot 49503-510，1998)。在水稻上，也筛选到了受单隐形核基因调控的滞绿突变体sgr(t)，并被定位在9号染色体长臂上的RFLP标记RG662和C985之间(Cha et al.，TAG.104526-532，2002)。时至今日，虽然报道了数种自然突变或通过人工诱变得到的滞绿突变体的生理和形态特征，但是目前还没有分离到具有显著调控衰老叶片中叶绿素降解动力学的关键基因。已克隆出的叶绿素降解代谢途径上的三个关键酶基因中(叶绿素酶基因，脱镁叶绿酸氧化酶基因，RCC基因)，只有脱镁叶绿酸氧化酶基因显示出一定的调控衰老叶片中叶绿素降解的潜力，但是该基因的突变和被过度抑制会引起有毒中间产物的积累，进而导致叶片上出现类似于创伤引起的坏死斑点(Hrtensteiner，S.Annu.Rev.Plant Biol.5755-77，2006)。
技术实现思路
本专利技术的目的是获得调控叶绿素代谢的关键基因AtNYE1及其植物滞绿突变体的创建方法。本专利技术的内容之一是从拟南芥中克隆了叶绿素降解代谢的关键调控基因AtNYE1；内容之二是利用AtNYE1基因，运用RNAi技术和借助于基因工程的手段，创建滞绿植物性状。本专利技术提出的一种调控叶绿素代谢的关键基因，该调控基因AtNYE1的核苷酸、氨基酸序列为SEQ ID No1。本专利技术提出了一种利用叶绿素降解代谢的关键调控基因AtNYE1，创建植物滞绿性状的方法。通过快中子诱变AtNYE1或同源性30％以上的基因，获得滞绿突变体，或抑制AtNYE1基因的表达，获得滞绿植物性状。本专利技术中，滞绿植物为绿叶类植物。本专利技术中，绿叶类植物为绿叶菜类植物。本专利技术中，绿叶类植物为牧草或草坪类植物。本专利技术中，T-DNA载体为RNAi载体，通过形成双链RNA抑制基因表达。本专利技术中，抑制基因表达的重组载体为35S启动子或者衰老诱导增强启动子。本专利技术中AtNYE1基因的克隆及其功能进一步描述如下1、快中子诱变拟南芥Columbia生态型在BARN(Biological Agricultural Reactor Nederlands，Wageningen)的辐射房间内，用快中子处理22℃下经过1.2％DTT浸泡3小时左右的拟南芥种子，辐射强度分别为20，33，47 and 60Gy，辐射剂率(dose rate)为1Gy/min，最大的辐射时间为3.5小时左右。为了使得环境条件均匀，辐射期间种子一直保持浸泡状态，直到辐射结束以后。辐射后的种子用自来水冲洗5分钟，然后播种。辐射一代(M1)自交产生M2种子，用于突变体筛选。2、滞绿突变体的筛选当植株的第6片叶片完全展开时，取每个植株的第4和第5片叶片(Roca et al.Phytochemistry 651231-1238，2004)，将叶柄浸没在水中，并转移至黑暗处进行离体处理(Weaver et al.，Plant Mol.Biol.，37455-469，1998)，3天后连续观察叶绿素降解情况，直至第10天。活体整株黑暗处理时，将三周大的野生型和突变体植株转移本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控叶绿素降解代谢的关键基因，其特征是该调控基因ＡｔＮＹＥ１的核苷酸、氨基酸序列为ＳＥＱＩＤＮｏ：１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒯本科，任国栋，安琨，廖阳，周霄，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]